ITS测序

利用ITS序列鉴定未知真菌温永芳2015.6.121：ITS鉴定原理2：PCR原理3：电泳原理4：具体操作目录微生物鉴定生理生化形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等分子鉴定细菌：16srDNA真菌：ITS序列一、ITS（InternalTranscribedSpacer）鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法ITS序列利用真菌rDNA上的5.8s，18s和28srDNA序列之间的转录间隔5.8s，18s和28srDNA序列进化上高度保守，而ITS序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定以及系统发育分析。二、PCR原理PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。三、琼脂糖凝胶电泳原理*提取微生物样品DNA*扩增出真菌ITS区序列*DNA测序，将样品序列与GenBank中已知序列进行比对*判定微生物种类，可将微生物划分到属或种*与同源性较高菌种构建系统发育树鉴定步骤包括：在PDA上培养七天的未知真菌一株实验材料①离心机②水浴锅③研钵④微量移液器仪器用具电泳仪器和试剂电泳仪、电泳槽、灌胶模具等琼脂糖、TEV缓冲液、样品缓冲液CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。CTAB提取缓冲液：2%W/VCTAB;100mMTris-ClpH8.0;20mMEDTA,pH8.0;1.4MNaCl一、真菌基因组DNA提取（1）取真菌菌丝0.2g，用液氮研磨充分，装入含有0.5mL预热的CTAB提取缓冲液的1.5mL离心管中,迅速混匀,在65℃水浴中保温1h,期间不定时摇匀；（2）放置室温，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(V/V:25∶24∶1)轻柔混匀，4℃、7500g离心10min；抽提去蛋白（3）取上清加入0.6倍体积异丙醇，室温下静置15min；沉淀核酸（4）4℃,10000g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次，无水乙醇洗一次，真空干燥5min；（5）将沉淀溶解在200μLpH8.0TEBuffer中。注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4℃保存。DNA提取操作步骤二、PCR加样体系真菌DNA模版2μL10×buffer2.5μLMgCl2（25mM）2μLdNTP（各2.5mM）2μL上游引物ITS1（10μM）1μL下游引物ITS4（10μM）1μLrTaq酶（5U/μL）0.3μLddH2O14.2μL总体积25μLPCR反应条件94℃预变性4min；94℃变性1min50℃退火1min72℃延伸1min72℃总延伸10min；10℃保温。32个循环1.凝胶制备制备1.0%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入20mL0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃时，缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样取10µlDNA样液与2µl上样buffeer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4.EB染色5.观察拍照三、琼脂糖凝胶电泳泳道1：DL2000泳道2：PCR产物ITS测序结果1TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCC61CATCCGTGTCTATTATACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGG121GGCGCCTTTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAA181GCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGG241TTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAG301TGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGT361CCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCG421GGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTT481TGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTTTTTCCAG541GTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA登陆Genbankblast在线比对序列比对分析谢谢！