细胞固定、染色原理与方法

一、固定与固定液(一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。1.目的(1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。(2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。(3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。(4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。(5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。2.时期(1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。(2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。3.固定时的注意事项(1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。(2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。(3)固定的时间要合适：与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。(二)固定液固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。1.固定液的条件(1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。(5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。(6)增加媒染作用和染色能力。(7)使组织变硬，具有一定的硬度。(8)固定以后能起到保存的作用。(9)在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。2.常用的几种固定液(1)酒精：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。酒精固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20%左右)，可使材料变硬。酒精常用于混合固定液中，但由于它本身是一种还原剂，很容易氧化成乙醛，甚至氧化成醋酸，因此最好不与三氧化铬、重铬酸钾及锇酸等氧化剂配合使用。但与甲醛、醋酸或丙酸配合，用作固定效果很好。酒精能溶解脂肪及凝脂，故不宜用来固定脂类材料。(2)甲醛水溶液：甲醛在水中的溶解度为37-40%，渗透力强，固定均匀，对组织收缩作用小，一般用于固定大材料。市售溶液中含量下降，因形成三聚甲醛而失效。(3)冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5%的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。(4)AF液：90ml乙醇10ml甲醛用于固定大块组织。(5)卡诺氏固定液：冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6改良卡诺氏固定液:冰醋酸:无水乙醇=1:3二、染色与染色原理根据染料的来源不同可分为天然染料(苏木精、洋红等)和人工合成染料（煤焦油染料，如碱性品红等）。1.苯与苯的取代物苯醌(红色)苯酚三硝基苯2.染料的分子结构呈酸或碱性，溶于水，可电离，可与材料结合。4.染色原理(1)化学作用碱性染料染细胞核；酸性染料染细胞质。(2)物理作用染料通过毛细作用或渗透作用进入组织内部；组织吸附染料；染料进入细胞，由于吸收作用而留在细胞内部。三、常用染料1.染细胞核(1)苏木精苏木用乙醚连续提取即可得到苏木精。苏木精为黄棕色结晶，溶于酒精、甘油，可氧化生成苏木红。常用于永久切片的制作，亲水力弱，不可单独使用。(2)卡红(洋红、胭脂红）取自雌胭脂虫，方法是将晒干后的成虫磨碎提炼出胭脂虫红，然后用明矾去杂质。卡红是一种复杂的化合物，起作用的是卡红酸。卡红在中性溶液里溶解度很小，所以要用酸性或碱性溶液溶解。醋酸洋红：45%醋酸100ml与1-2g卡红混合，煮沸，充分溶解，凉后过滤。1-2个月后加媒染剂铁即可使用。主要染细胞核，若时间太长，细胞质也被染红。(3)碱性品红染细胞核的特异染料。2.染细胞质伊红Y、刚果红、苦味酸、酸性品红（品红磺基）四、洋葱根尖有丝分裂的观察流程：固定好的根尖→水洗2-3次→1NHCl7-8min→水洗2-3次→取材(1/2分生区)→切碎→染色6-7min→加盖玻片→轻敲→压片→观察。1.材料准备：将洋葱放在加满水的广口瓶上，使其根茎部接触水面，然后转移到25-28℃的条件下培养。待根尖长到2cm左右使，在上午9-10点剪取根尖备用。2.预处理：为了有利于对有丝分裂过程中染色体的观察和计数，在固定前应对根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。(1)低温预处理将材料浸在蒸馏水中，放在1-4℃冰箱内离体处理24h。此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种作物都适用。(2)药物预处理①0.05-0.2%秋水仙素溶液与室温下处理2-4h，对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的中期分裂相，且染色体收缩较直，有利于染色体结构的研究。②饱和对二氯苯溶液室温下处理3-5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，但对染色体小而多的植物来说个利于染色体的计数。③0.002-0.00mol/L8-羟基喹啉18℃条件下处理5-6h，可以引起细胞粘度的改变，导致纺锤体活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。一般认为对中等或长染色体的植物较合适。④70ppm放线菌酮和250ppm8-羟基喹啉的混合液于25℃条件下，根尖不离体处理5h，可获得大量的分裂相，是最值得首选的预处理方法。3.固定：:预处理后的根尖用蒸馏水冲洗2-3次，然后移入Carnoy’s固定液中，室温下固定2-24h后，用70%酒精冲洗2次转入70%酒精中于4℃冰箱中保存，最好不要超过2个月。如经过较长时间保存的材料，在使用前可以用固定液在处理一次。4.解离：解离有酸解和酶解两种方法，可以使分生区组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易压平。酸解一般用1NHCl在60℃水浴中处理7-8min即可。5.压片和染色：取处理好的根尖置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用刀片将根尖的分生组织切下并切碎，加1-2滴改良苯酚品红染液，6-7min后加盖玻片。用铅笔的橡皮头或小镊子的柄端轻敲盖玻片，使材料均匀分散，然后压片。压片时用力要适当，不要移动盖玻片。6.镜检：低倍镜下找到分生区细胞，其特点为等直径细胞。细胞质浓厚，细胞核较大，占细胞体积的3/4。可以观察到有丝分裂过程中不同分裂时期的染色体。选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意细胞核染色体及纺锤体的变化动态。注意事项：(1)取材：取分生区，尽量要小；(2)解离要软，水洗要彻底，否则不易着色；(3)压片前先敲，可使细胞分散开；(4)防止出气泡低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075MKCl为低渗液（具体情况取决于实际操作），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。