食品中蛋白质和氨基酸的测定(精)

第八章食品中蛋白质和氨基酸的测定一、测定意义蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。二、蛋白质和氨基酸的分类三、蛋白质的一般性质1．物理性质2．化学性质第二节蛋白质的测定蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法是最常用的，国内外应用普遍；双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法；国外：红外分析仪一、常量凯氏定氮法食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。蛋白质的含氮量一般为15%~17.6%，有的上下浮动,可以测出总氮.N/16%=N×6.25=蛋白质含量凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。[原理]样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。[步骤]整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定1.消化总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O为了加快消化速度，一般添加硫酸钾、硫酸铜等催化剂，也可加入氧化剂。（1）加硫酸钾：作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。（2）加硫酸铜：作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。（3）加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。装置：219页（要防止爆沸）。2.蒸馏消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。3.吸收与滴定1用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。2用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。[结果计算]：158页注意：F——氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25，也可查表。[说明]①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3m1后再继续加热消化。⑥若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5m1的比例增加硫酸用量。⑦—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。⑧蒸馏装置不能漏气。⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在70～90℃时发黑。⑩蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。二、比色法第三节氨基酸总量的测定1．单指示剂和双指示剂甲醛滴定法12．茚三酮比色法3．氨基酸自动分析仪法（简介）第九章食品添加剂的检验第一节概述一、食品添加剂的概念、分类和测定意义1．概念食品添加剂是指为改善食品品质和色、香、味以及防腐和加工艺的需要而加入食品中的化学合成或者天然物质。这些物质本身不作为食用目的，也不一定有营养价值。但不包括污染物、残留农药。2．分类食品添加剂的种类很多，按其来源分为天然食品添加剂和化学合成添加剂天然食品添加剂：利用动、植物组织或分泌物及以微生物的代谢产物为原料，经过提取、加工所得到的物质。如：Vc、淀粉糖浆、植物色素等。化学合成添加剂：通过一系列化学手段所得到的有机或无机物质。3．测定意义为了保障食品安全！二、食品添加剂的使用及管理第二节食品添加剂的测定食品添加剂的检测也是先分离再测定。分离——蒸馏法、溶剂萃取法、色层分离等。测定——比色法、紫外分光光度法、TLC、HPLC等。一、发色剂的测定发色剂又名护色剂或呈色剂，是能够使肉与肉制品呈现良好色泽的物质。常用的有亚硝酸盐、硝酸盐。发色剂的发色机理：亚硝酸盐和硝酸盐→亚硝基(NO)+肌红蛋白→亚硝基肌红蛋白(MbNO)→巯基(一SH)→亚硝基血色原（鲜红色的）从而赋予食品鲜艳的红色。同时，亚硝酸盐对抑制微生物的增殖有一定作用，与食盐并用可增加抑菌，对肉毒梭状芽孢杆菌有特殊抑制作用。发色剂的毒性亚硝酸盐和硝酸盐作为食品添加剂，过多地使用对人体产生毒害作用。亚硝酸盐与仲胺反应生成具有致癌作用的亚硝胺。1．亚硝酸盐的测定（GB/T5009.33—2003）《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》盐酸萘乙二胺比色法[原理]样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长为538nm，可测定吸光度并与标准比较，定量。[注意]盐酸萘乙二胺有致癌作用，使用时应注意安全。2。硝酸盐的测定镉柱法[原理]样品经沉淀蛋白质、去除脂肪后，得到提取液，将提取液通过镉柱，在pH9.6～9.7的氨缓冲液中，使其中的硝酸根还原为亚硝酸根，然后利用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的总量，由总量减去还原前亚硝酸盐含量即为由硝酸盐还原产生的亚硝酸盐含量。再乘以换算系数，即得硝酸盐含量。在镉柱中，镉定量地将NO3-还原成NO2-Cd十N03-CdO十N02-镉柱经使用后用稀盐酸除去表面的氧化镉可重新使用CdO十2HCl→CdCl2十H2O[注意]：在制取海绵状镉和装填镉柱时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化。3．其他方法紫外分分光度法同时测定硝酸盐和亚硝酸盐；荧光法测定亚硝酸盐含量；离子选择性电极法测定硝酸盐；气相色谱法测定硝酸盐和亚硝酸盐二、食用合成色素的测定食用色素就来源可分为天然色素及人工合成色素两大类。天然色素——是从一些动、植物组织中提取的，目前我国开发有80余种。如：红曲米粉、辣椒红、辣椒黄、姜黄、叶绿素铜钠盐、虫胶、番茄红素、红花黄、焦糖色、胡萝卜素、黄酮类色素等。优点：其安全性相对高，有的有营养价值，个别有毒如：藤黄剧毒！缺点：稳定性差，着色能力差，难以调出任意的色泽，且资源较短缺，目前还不能满足食品工业的需要；合成色素---是用有机物合成的，主要来源于煤焦油及其副产品，资源十分丰富。合成色素具有稳定性好、色泽鲜艳、附着力强、能调出任意色泽等优点，因而得到广泛应用，但由于其具有一定的毒性，使用范围及用量须加以限制。常用的合成色素有：笕菜红、胭脂红、赤藓红、桔黄、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝等。1．几种常见合成色素的分子结构：苋菜红胭脂红柠檬黄日落黄靛蓝亮蓝2．合成色素的提取聚酰胺吸附色素3．定性分析14．定量分析5．薄层层析法、高效液相色谱法测定的基本要求三、甜味剂的测定糖精钠的测定：糖精是应用较为广泛的人工甜味剂其学名为邻—磺酰苯甲酰亚胺其结构式为：1．HPLC法2．酚磺酞比色法[原理]样品中的糖精钠在酸性条件下用乙醚提取分离后，与酚和硫酸在175℃作用，生成酚磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色溶液，与标准系列比较定量。[说明]①本法受温度影响较大，要使糖精充分与酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在175士2℃温度下反应2小时。②苯甲酸等有机物对测定有干扰，故要通过碱性氧化铝层析柱以排除干扰。3．紫外分光光度法四、防腐剂的测定防腐剂是能防止腐败、变质、抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的一类物质的总称。虽然有些防腐剂被认为是比较安全的，但长期或大量使用不行，应尽量少用甚至不用。防腐剂还在烟草、化妆品、牙膏、药品中应用防腐剂的品种：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、EDTA二钠、亚硝酸钠、丙酸及其盐、乳酸链球菌素等。新开发的：果胶分解产物、香辛料提取物、琼脂低聚糖、甜菜碱、日扁柏醇、类黑精、葡萄糖氧化酶、熏液、富马酸二甲酯、溶菌酶、鱼精蛋白等。禁用的防腐剂：水杨酸、甲醛、硼酸、β-奈酚、焦碳酸二乙酯等。1苯甲酸的测定苯甲酸又名安息香酸。为白色有丝光的鳞片或针状结晶，微溶于水，使用不便，实际生产多用其钠盐。苯甲酸钠易溶于水和乙醇，难溶于有机溶剂，与酸作用生成苯甲酸。苯甲酸及其钠盐主要用于酸性食品的防腐，在pH2.5—4其抑菌作用较强，当pH＞5.5时，抑茵效果明显减弱。对霉菌和酵母菌效果甚差。苯甲酸进入人体后，大部分与甘氨酸结合形成无害的马尿酸，其余部分与葡萄糖醛酸结合生成苯甲酸葡萄糖醛酸甙从尿中排出，不在人体积累。苯甲酸的毒性较小。（1）滴定法测苯甲酸（适于样品中苯甲酸含0.1%以上）苯甲酸微溶于水，用乙醚从样品中提取，蒸去乙醚，以标准NaOH滴定。若样品中是苯甲酸钠，先让其与酸作用成苯甲酸，再按上法测定。（2）其他方法薄层色谱法；紫外分光光度法气相色谱法2．山梨酸的测定山梨酸又名花楸酸，(CH3CH=CHCH=CHCOOH)，为无色、无嗅的针状结晶，难溶于水。山梨酸钾易溶于水，难溶于有机溶剂，与酸作用生成山梨酸。比苯甲酸更安全，在体内最后成CO2和水。测定方法有：硫代巴比妥酸比色法、紫外分分光度法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法五漂白剂的测定漂白剂是为使食品保持特有的色泽、退色或不褐变。依靠漂白剂的氧化或还原能力，破坏食品的变色因子。（1）食品中的漂白剂本身无营养价值。（2）严格控制使用量，因为对人体健康有一定影响。（3）要求对食品的品质、营养价值及保存期不应有不良影响。二氧化硫及亚硫酸钠的测定：二氧化硫及亚硫酸盐的测定方法有多种。1．盐酸副玫瑰苯胺比色法(国标中第一法)[原理]亚硫酸盐或二氧化硫，与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质，其色泽深浅与亚硫酸含量成正比，可比色测定。反应式如下：副玫瑰苯胺盐酸副玫瑰苯胺黄色[说明]：①颜色较深样品，需用活性炭脱色。②样品中加入四氯汞钠吸收液以后，溶液中的二氧化硫含量在24小时之内稳定，测定需在24小时内进行。（四氯汞钠作为萃取剂，如果用水萃取，易造成SO2的丢失，20℃时，1体积水溶解40体积SO2）。③此方法适用于含SO2＜50ppm,含量高时适于用碘量法及中和法测定。④四氯汞钠毒性甚大，有人研究用EDTA代替。2．蒸馏滴定法[原理]在密闭容器中对样品进行酸化并加热蒸馏，蒸出二氧化硫，然后用乙酸铅溶液吸收，用浓盐酸酸化，再用碘标准溶液滴