GST-pull-down试验方法(自己总结)

12.GST蛋白的表达和纯化12.1GST蛋白的表达（1)将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。（2)挑单克隆于3mlLA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。（3)将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。（4)28℃,220rpm摇菌培养2小时。（5)加入50μl100mMIPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。（6)收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpmx5min离心，弃上清。（7)加入10mlPBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。（8)加入2mlPBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。（9)超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/mlPMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。破壁参数：Frequency:100～200w60s，pause20srun40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加100μl20%TritonX－100，冰上放置30min。（10)将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。（11)吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。12.2准备50%GSTSepharose4Bslurry（1)将原75%GlutathioneSepharose4B的slurry弹至混匀。（2)取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。（3)加500μlPBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复5次。（4)加500μlPBS，颠倒混匀，配成50%GlutathioneSepharose4B备用。12.3GST融合蛋白的纯化（1)在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%GlutathioneSepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。（2)3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3)在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose上结合6～10ml裂解液中的GST融合蛋白。（4)在管中加入预冷的200μlPBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，3krpm离心3min，弃上清。（5)反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose。（6)如果用于检测，在Sepharose加入15～20μl1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。12krpm离心1min，取上清作SDS-PAGE电泳。（7)如果用于pull－down测试，参见pull－down步骤。14.体外蛋白质结合分析（GST-pulldown）（1)将结合有GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B悬浮在500μlNETN缓冲液中加入20～30μl含有其他蛋白的溶液，例如pET发酵的产物,细胞表达的产物等，同时采用结合有GST空蛋白的GlutathioneSepharose4B平行操作作为对照。（2)在水平摇床上，4晃动4～8小时。（3)离心（3.6krpm,2min）。吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose.（4)加入200μl缓冲液H对Sepharose进行洗涤。注意加入缓冲液H时要贴壁加，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可。（5)低速离心（3krpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose。（6)重复步骤的洗涤2～3次。（7)吸干Sepharose上方的水层后，加入20～30μl1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于－20℃。（8)做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。GST试验流程（梗概）：（1）Glutathione琼脂糖珠预处理。（2）GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads置于1.5ml离心管中，4℃,摇床孵育过夜。（3）孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。（4）把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.5ml细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心20min,收集上清液。（5）将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。（6）3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。（7）加15μl2×SDS上样缓冲液，煮沸5min.（8）SDS-PAGE,WesternBlot或质谱仪分析。（9）对照（GST）同样处理。13.pET融合蛋白的表达与纯化13.1pET32a融合蛋白的表达（1)将表达融合蛋白的质粒转入BL21DE3中。（2)挑单克隆于3mlLA培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。（3)将种子液稀释于50ml2×YTG中，使起始OD600为0.1。（4)28℃,220rpm摇菌培养2小时。（5)加入50μl100mM的IPTG,22℃摇菌培养6小时。（6）收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpm离心5min，弃上清。（7)加入10mlNi-lysisbuffer/管，重悬菌体。5krpm离心5min，弃上清。（8)加入2mlNilysisbuffer/50ml菌液，vortex重悬菌体。转移至5ml离心管。（9)超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/mlPMSF,80ul蛋白酶抑制剂。破壁参数：Frequency:100～200w,60spause20srun40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加100μl20%TritonX100，冰上放置30min。（10)将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。（11)吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS－PAGE电泳，检测表达情况。13.2pET32a融合蛋白的纯化（1)在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μlNi-NTA珠子，4℃，摇床上摇反应30min～60min。（2)离心3krpm×5min，弃上清。该珠子上即结合了pET32a融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3)在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。离心3krpm×5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使珠子上结合6～10ml裂解液中的pET融合蛋白。（4)在管中加入预冷的200μlWashbuffer（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，洗涤一次，离心3krpm×3min，弃上清。（5)反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有pET融合蛋白的Ni-NTA。（6)加入60μlElutionbuffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。离心3krpmx5min，吸净上清，pET融合蛋即在上清中。（7)如果用于检测，取1～2μl样品，配成15～20μl1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。离心12krpm×1min，取上清作SDS-PAGE电泳。（8)如果用于pulldown测试，参见pulldown步骤。GSTpulldown与IP之间区别：Co-IP一般来说是证明两个蛋白的相互作用，但不排除通过第三个蛋白介导的间接相互作用。GSTpulldown一般可用来证明直接的相互作用。GSTpulldown也并非都是原核表达来源，真核也可以表达作为饵蛋白GSTpull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase)GST:体外纯化蛋白，预测有相互作用的蛋白放在一起（EP管中）证明二者是否有直接相互作用。体外可能相互作用，但在体内不一定相互作用。IP：体内（细胞内证明）两种蛋白是否相互作用，但二者不一定直接作用，可能通过桥梁作用在一起（间接作用）