四环素诱导调控表达系统的研究与应用

《生命的化学》2011年31卷2期·285·●技术与方法CHEMISTRYOFLIFE2011，31(2)文章编号:1000-1336(2011)02-0285-07四环素诱导调控表达系统的研究与应用陈皓　夏海滨陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室，西安710062摘要：四环素(Tet)诱导调控表达系统是在大肠杆菌Tn10转座子中特异的Tet抗性操纵子基础上建立起来的一种用于诱导基因表达的调控系统。经过近几年来的发展，衍生出了Tet-on、Tet-off两套调控系统；随着对Tet诱导调控表达系统的改进，其对基因表达调控的严谨性、诱导效率及安全性等方面逐步得到改善，并被广泛应用于基础研究及体内外的实验治疗研究。此外Tet诱导调控系统与其他诱导调控体系及新兴技术的联合应用，为疾病的基因治疗研究提供有力的手段。关键词：四环素；基因治疗；诱导调控中图分类号：Q78收稿日期：2010-10-08国家自然科学基金项目(30872993)资助作者简介：陈皓(1982-)，男，硕士生，E-mail：[e-mail]；夏海滨(1965-)，男，博士，教授，通讯作者，E-mail：[e-mail]基因的调控表达可以使基因功能的研究变得更为细致。此外，在基因治疗过程中任何外源基因的过度或不适当的表达都会影响到基因治疗的效果。因此实施对基因表达的调控无论是在基因功能研究方面还是在疾病的基因治疗研究中都具有十分重要的意义及实际应用价值。1992年Gossen等[1]成功地利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline,Tet)真核细胞基因调控表达系统，它利用Tet及其衍生物对所感兴趣的基因进行诱导表达。随着人们对该系统的不断改进，使这种诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点。目前真核细胞基因诱导表达系统已被广泛应用于基因功能研究及基因治疗研究，为疾病的基因治疗提供了安全的体系。本文将从Tet诱导调控基因表达系统的作用原理、系统改进及其应用等方面的研究作一综述，从而为人们选择合适的诱导表达系统用于自己的研究提供有用的信息。1.Tet诱导调控表达系统的作用机理Tet诱导调控表达系统的基本原理是由诱导药物如Tet改变调控蛋白质的构象，从而控制目标蛋白质的表达[图1(A)]。最初的Tet诱导调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tetrepressorprotein,TetR)与Tet操纵基因(Tetoperator,TetO)DNA序列有特异的亲和能力，当细胞内无Tet存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的抗性基因表达。当有Tet存在时，药物使TetR的构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。利用TetR和TetO特异结合的特性，研究人员发展了多种类型的Tet调控系统，但根据其表达特点可以归为两大类：抑制型系统Tet-off和激活性系统Tet-on。1.1Tet-off系统Gossen等[1]最早建立了Tet-off基因调控表达系统，该系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个由人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)启动的Tet转录活化因子(tetracyclinetranscrip-tionalactivator,tTA)，tTA由TetR与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白质C端的一段转录激活区融合而成。反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsiveelement,TRE)、最小CMV启动子(minimalCMVpromoter,PminCMV)及目的基因组成。目的基因位于TRE和PminCMV的下游；TRE为7次重复的TetO序列。PminCMV缺失增强子，因此在tTA未结合到TRE时，目的基因不表达；相反，当tTA结合到TRE时，VP16会使PminCMV活化从而使基因表达。当细胞内无Tet或其衍生物强力霉素(doxcycline,Dox)的存在时，tTA可与TRE结合，《生命的化学》2011年31卷2期CHEMISTRYOFLIFE2011，31(2)·286·●TechniqueandMethod图1　Tet诱导调控系统的结构和原理[39]《生命的化学》2011年31卷2期·287·●技术与方法CHEMISTRYOFLIFE2011，31(2)打开基因表达；而当Tet或Dox存在时，它们可使tTA中的TetR改变构象，则tTA将从TRE上脱落下来，使TRE中的PminCMV处于非激活状态，从而使基因表达处于关闭状态[图1(B)]。1.2Tet-on调控系统Tet-on调控系统与Tet-off调控系统的区别在于其调节蛋白质为反义Tet转录活化因子(reversetetracy-clinetranscriptionalactivator,rtTA)。rtTA是由反义TetR(reverseTetR,rTetR)与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR由TetR中的4个氨基酸发生突变而衍生而来的[2](E71→K71,D95→N95,L101→S101,G102→D102)。rTetR的表型与TetR相反，在无Dox时其不能结合TRE，导致基因表达关闭；而在有Dox存在时其会结合在TRE上，导致基因表达开放[图1(C)]。2.Tet诱导调控表达系统的优点Tet系统具有低本底与高诱导倍数的特点。无诱导时目的基因表达水平低，诱导时其表达水平增高，最高诱导倍数可达10,000倍。目的基因的诱导倍数与诱导剂的量及诱导时间存在一定的关系，所以人们可以采用Tet诱导调控表达系统对基因表达进行精确的调节。原核来源的TetR与TetO的结合特异性高，哺乳动物细胞中无类似的DNA靶序列，因此该系统调控特异性高，宿主基因不受影响，适合于体内外的各种基因表达的调控。Tet系统的诱导药物为Tet或其衍生物(如Dox)。Tet作为一种抗生素已被人们应用了很长时间，是对人体较为安全的一种药物。并且在Tet系统中低剂量的Tet就可调节基因的表达，所以不会对动物或细胞产生强毒性。该系统诱导所需的时间短，在加入诱导剂30分钟内即可检测到目的基因的表达；当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭，之后仍可通过加入诱导剂重新开启，因此该诱导系统是一种可逆系统。诱导药物如Dox等可穿越胎盘屏障，也存在乳汁中，故该系统适用于转基因研究。3.Tet诱导调控表达系统的改进Tet诱导调控表达系统尽管得到了广泛的应用，但是依然存在不足，为此人们对该系统做出了一些改进。3.1tTA/rtTA的改造通过体内研究发现，要完全激活Tet-On系统中的PminCMV启动子需要小鼠体内Dox的浓度达到1-2μg/ml[3]，而血脑屏障的阻碍作用使得脑组织中的Dox很难以达到该作用浓度[4]，因此限制了Tet-on系统在脑组织中的作用。同时当在Dox不存时，rtTA与TetO仍可以结合，造成了该系统具有一定的背景表达。(A)Tet系统的基本结构示意图。Tet系统由调控蛋白(tTA,rtTA,tTS,rtTS)的表达框和目的基因表达框组成。调控蛋白由一个强启动子驱动；而在目的基因的表达框中，启动子位于Tet应答元件(Tet-responsiveelement,TRE)的下游，调控蛋白可以通过TRE对下游启动子进行调控。(B)Tet-off示意图。tTA是由TetR和病毒转录激活域VP16融合而成的蛋白。当不存在Dox时，tTA和TRE结合，启动PminCMV的下游基因表达；当存在Dox时，Dox使tTA的构象发生改变，tTA会从TRE上脱落，从而导致TRE-PminCMV下游基因表达关闭。(C)Tet-on示意图。rtTA是由rTetR和VP16融合而成的蛋白，它的表型与tTA相反。当Dox不存在时，rtTA不能结合TRE，TRE-PminCMV下游基因表达关闭；当存在Dox时，rtTA构象改变，rtTA结合TRE，则TRE-PminCMV下游基因表达开启。(D)KRABTet-on示意图。tTS是由TetR与强转录抑制因子Kox1蛋白N端具有转录抑制作用的KRAB-AB区域融合而成的。当Dox不存在时，tTS结合TRE，下游基因的表达被抑制；当Dox存在时，tTS不结合TRE，则下游基因表达开启。(E)KRABTet-off示意图。rtTS是和tTS相反表型的调控蛋白。当Dox不存在时，rtTS不结合TRE，下游基因的表达开启；当Dox存在时，rtTS结合TRE，则下游基因表达被抑制。(F)复合Tet-off系统示意图。复合的Tet-Off系统同时存在tTA和rtTS两种调控蛋白。当Dox不存在时，rtTS不结合TRE，不对启动子进行抑制，同时tTA结合TRE激活启动子，基因表达开启；当Dox存在时，tTA从TRE上脱落，启动子不被激活，同时rtTS结合TRE，抑制下游基因表达。(G)复合Tet-On系统示意图。该系统同时存在rtTA和tTS两种调控蛋白。当Dox不存在时，rtTA不结合TRE，不激活启动子，同时tTS结合TRE，抑制启动子，基因表达关闭；当Dox存在时，tTS从TRE脱落，基因抑制解除，同时rtTA结合TRE，启动子被激活。(H)自身循环调控的Tet-On系统示意图。该系统是将调控蛋白rtTA放在其自身启动子之后并通过内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysite,IRES)连接目的基因，使调控蛋白和目的基因受控于同一个启动子。当Dox不存在时，rtTA几乎不表达，且不与TRE结合，启动子无法激活，基因表达关闭；当Dox存在时，微量表达的rtTA逐渐激活启动子，使自身的表达量也升高，实现逐级放大的效果，从而导致目的基因的开启。《生命的化学》2011年31卷2期CHEMISTRYOFLIFE2011，31(2)·288·●TechniqueandMethodUrlinger等[3]对tTA的DNA进行了随机突变和筛选，得到了tTA突变体rtTA-S2。该突变体中tTA上的四个氨基酸发生了了突变，即E19→G19，A56→P56，D148→E148，H179→R179。与rtTA相比rtTA-S2目的基因的背景表达降低了。在rtTA-S2的基础上再将第12位甘氨酸进行突变，即S12→G12，得到突变体rtTA-M2，此突变体除了低背景外，还对Dox的诱导更为敏感，其使基因表达水平达到最大的诱导药物Dox的浓度仅为rtTA-S2的1/10。Baron等[5]合成了VP16蛋白中具有转录激活作用的12个氨基酸(436~447)，得到一个最小活化区域(F区域)，并将F区域的多聚体(2~8个F区域)连到TetR上，而Kämper等[6]则将L区域(较F区少2个氨基酸)的多聚体连到rtTA或其突变体rtTA-M2上，如此产生出的新的tTA/rtTA均使目的基因基础表达水平下降，它们诱导目的基因表达的能力也都增强，L片段的诱导能力则更强，同时细胞可以容忍更高浓度的tTA/rtTA存在，这也许是因为去除了VP16中可与细胞内其他转录活化因子相互作用及可能在细胞内诱发免疫应答的功能部分，使得tTA/rtTA的细胞毒性降低。而更换活化因子是另一种降低tTA/rtTA毒性的方法，Akagi等[7]将rTetR与人的E2F4的转录活化区融合出一种新的转录活化因子，它可在哺乳动物各组织中表达，且有较强的转录活性，适合在多种细胞系中对目的基因进行诱导调控，同时无细胞毒性。Urlinger等[3]还发现编码TetR和VP16融合蛋白的mRNA存在剪切位点，转录过程中会发生自身的剪接，从而降低了tTA/rtTA蛋白的合成，导致目标基因表达水平降低。他们将3个F区域分别与rtTA-S2及rtTA-M2组成融合蛋白，并将其DNA中的原核密码子转换为人类基因密码子，同时去掉DNA序列中的剪切位点以及在mRNA水平产生发夹结构的DNA序列，由此形成了两种新rtTA，分别被称为rtTA