第四章聚合酶链式反应

第四章聚合酶链式反应聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。1971年，Khorana提出：DNA经过变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…4.1PCR技术简史4.1PCR技术简史1985年，美国PE-Cetus公司Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶I的Klenow片段进行PCR，4.1PCR技术简史1988年Saiki等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热-TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖72℃94℃55℃PCR循环PCR仪PCR反应4.2PCR反应原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸PCR双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72oC理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。（5）1个循环的结果（4）新一轮循环开始PCR反应曲线4.3PCR的过程（1）第一步变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第四步变性（denature）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步延伸（extend）（5）第五步重复（repeat）第二步——第三步——第四步复性延伸变性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min温度循环需要的模板量极低。4.4PCR的特点（1）特异性强①PCR使用专门合成的DNA引物。②延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！RT-PCR：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA（4）简便先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（3）快速整个PCR过程约4小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。4.5标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶4.6影响PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①热稳定性最适温度：72-78oC延伸速度：约1000nt/min酶分子最长延伸长度：6.7kb②最适温度高③Taq酶的功能缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。金属离子敏感（尤其是Mg2+）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。（2）引物（primer)①位置3’3’即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。②引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15—30bp。③引物的碱基序列5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力④引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列.5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构1）2）3）避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5oC。手工计算：一般估计：⑥引物的浓度一般使用终浓度各0.2mol/L。⑦简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性（3）dNTP（4）模板DNA但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。②模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。①纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少（5）Mg2+①一定范围内提高退火温度；②缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会；③降低引物和酶的浓度可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；④改变Mg2+的浓度；4.7提高PCR扩增的特异性⑤引物设计的特异性；⑥减少循环次数；⑦热启动（HotStart）⑧采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。典型的引物1５到30个核苷酸长；选择GC含量为45％到55％碱基的分布是随机的；避免引物间和引物内产生４碱基以上互补；避免3‘末端的错误配对；设计5‘端和中间区为G或C的引物；避免引物对3‘末端存在互补序列；避免3‘末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。避免存在可能会产生内部二级结构的序列。4.7引物设计的基本原则：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmolRT-PCR引物设计特别注意：跨越两个外显子附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5’端而不影响特异性。引物5′端修饰技术修饰法用途附加核酸序列：酶切位点克隆（如定向克隆）噬菌体启动子合成RNA探针、测序蛋白质结合序列产物纯化、检测核糖体结合序列高效表达其它构建载体、重组子等4.8聚合酶链式反应技术类型①巢式PCR：是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出第一对引物,扩增25个循环,然后根据序列设计第二对引物(在第一对引物内部),如此扩增,不受平台效应限制,灵敏度高。选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在35度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。②降落PCR③竞争引物PCR：有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。准确配对引物错配引物共同引物PCRoror模板模板or④不对称PCR低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。3’5’5’3’引物少用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。⑤锚定PCR：锚定PCR是在未知DNAcDNA片段的一个末端人工接上一个已知序列片段,利用一个基因特异引物与这个人工序列区引物（锚定引物）进行扩增，所以它是一种半特异性扩增。⑥反向PCR：扩增两个引物外侧的未知序列把线性DNA模板转变成环形分子。templatetemplate3’5’5’3’（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。⑦兼并引物PCR（DegeneratePrimer）⑧RT-PCR（reversetranscription-PCR）在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应。Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。RNAtemplate3’5’下游引物cDNAfirststrand3’5’上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’5’3’5’反转录酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶小牛肠磷脂酶烟草酸性焦磷酸酶⑨实时荧光定量PCR常规定量PCR技术：—对PCR扩增反应的终产物进行定量—重复性差