生化仪器分析与实验技术在药物质控研究中的应用

生化仪器分析与实验技术在药物质控研究中的应用杨化新生化药品与基因工程药物室中国药品生物制品检定所生化仪器分析与实验技术生命学科研究集多学科为一体：光学、电学、化学、生物化学、免疫学综合性实验技术四大实验技术：光谱分析、电泳技术、免疫学技术、层析技术生化仪器特点：功能多样化、操作智能化、测定微量化生化药品的定义与分类一般系指从动、植物及微生物中提取、分离、纯化，或用生物化学半合成或用现代技术制得的具有生物化学活性的一类用于临床治疗的药物:氨基酸及其衍生物酶与辅酶核苷酸及其衍生物肽与蛋白多糖类脂类基因工程药物的质控特点目前，研发成果主要集中在蛋白质和多肽类药物，其质控内容主要有：－结构确认－理化性质鉴别－纯度与杂质检查－效价与含量测定－生物活性测定基因工程药物来源于活的生物体（细菌或细胞〕，它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如发酵、细胞培养、分离纯化目的产物等，这些过程有其固有的易变性，必须对原材料、培养过程、纯化工艺过程、最终产品进行全面的质量控制。临床应用溶栓类tPAUKSKK2tPATNK－tPA纤溶酶人水蛭素类似物抗肿瘤门冬酰胺酶TNFa人精氨酸酶抑肽酶舍雷肽酶蕲蛇酶抗病毒利巴韦林阿昔洛韦干扰素聚肌胞苷酸肌苷环磷腺苷降血糖人胰岛素及其类似物、人促胰岛素分泌素治疗心脑血管病弹性蛋白酶胰激肽原酶生长抑素促生长人生长激素制剂促生殖卡贝缩宫素人促卵泡激素人绒促性素人促黄体生成素曲普瑞林制剂抗炎症胰蛋白酶糜蛋白酶复合凝乳酶木瓜酶超氧化物歧化酶胶原酶凝乳酶菠萝蛋白酶酸性蛋白酶溶菌酶玻璃酸酶止血尖吻蝮蛇凝血酶、血凝酶、凝血酶、巴曲酶、蛇毒激凝酶消化复方消化酶片胰酶胃蛋白酶中性蛋白酶淀粉酶胰脂酶治疗高尿酸血症假丝酵母尿酸氧化酶治疗I型戈谢病阿糖苷酶β-葡萄糖脑苷脂酶补充营养增强免疫力氨基酸输液脂肪乳脑磷脂卵磷脂猪苓多糖生物化学实验技术1.光谱分析技术2.层析技术3.色谱分析技术4.电泳技术5.免疫学技术6.离心技术7.膜分离技术光谱技术:(1)紫外:氨基酸、核苷酸、肽、蛋白、酶、糖；(2)红外:氨基酸、核苷酸、辅酶；(3)核磁:氨基酸、核苷酸、辅酶、肽、衍生物；(4)质谱:氨基酸、小肽、核苷酸；(5)拉曼光谱:蛋白、糖；(6)圆二色光谱:蛋白、糖(7)原子吸收：蛋白和酶中的金属离子(8)荧光发射：氨基酸、核苷酸、肽、蛋白；层析与色谱分析技术(1)纸层析:氨基酸、糖、核苷酸(2)板层析:氨基酸、核苷酸、脂；(3)柱层析:氨基酸、核苷酸、蛋白脂；(4)气相色谱:有机残留杂质；(5)液相色谱:氨基酸、肽、蛋白、核酸、糖、脂(6)气质联用：脂、肽、蛋白、核糖；(7)液质联用：肽、蛋白、核糖；(8)临界色谱：肽、蛋白、核糖。电泳技术:(1)纸电泳氨基酸、糖、核苷酸(2)淀粉电泳氨基酸、核苷酸(3)淀粉凝胶电泳糖、核苷酸(4)琼脂凝胶电泳与免疫电泳核酸蛋白质(5)PAGE核酸多肽蛋白质酶(6)SDS-PAGE多肽蛋白质酶(7)等电聚焦电泳多肽蛋白质酶(8)毛细管电泳核酸多肽蛋白质(9)等速电泳多肽蛋白质酶现代仪器分析1.DNA序列仪2.氨基酸序列仪N－末端aa序列3.飞行时间质谱分析仪MALDI-TOF/MS分子量质量肽图纯度糖蛋白微观不均一性4.电喷雾质谱分析仪分子量微观不均一性5.多功能电泳仪分子量纯度等电点电印记双向电泳6.C末端肽段分馏仪7.园二色光谱仪蛋白质二级结构8.激光拉曼光谱仪:蛋白二级结构与构象生物膜结构9.库仑水分测定仪684KF微量水分10.多功能荧光微板仪SPECTRAMAXGEMINIXS体外细胞活性残余DNA11.多功能酶标仪SPECTRAMAX190型体外细胞活性宿主蛋白12.液相色谱质谱仪分子量质量肽图13.不溶性微粒测定仪HIAC/ROYCO8103型制剂中微粒14.高效液相色谱仪岛津惠普沃特斯纯度与杂质检查效价与含量测定肽图谱15.高效毛细管电泳仪肽图谱纯度含量16.液闪仪放免活性测定17.多角光散射仪多亚基蛋白多糖质控内容－结构确认－理化性质检测－纯度与杂质检查－含量测定－生物活性测定－效价测定－安全性检查主要质控技术－生化分析技术－生物学技术(1)HPLC法（分子筛、反相、疏水相互作用、阴离子交换、氨基柱）鉴别和肽图谱测定（胰酶、V8酶、胃蛋白酶）；检查有关物质或高分子蛋白或游离PEG；含量测定；(2)多肽与蛋白质的Western-blotting及其免疫学测定(3)等电聚焦法电泳法检测等电点和异构体；（4）SDS－PAGE法测定蛋白和多肽分子量和纯度；(5)底物法或凝块裂解法测定酶活性；(6)分子杂交－免疫法检测残余DNA；(7)免疫分析法检测E.coli肽或宿主蛋白；(8)体外细胞培养法测定效价；（9）高校毛细管电泳检测纯度；（10）银染SDS－PAGE法检测解离亚基或聚合物；肽图谱测定与分析目的鉴别蛋白质一级结构是否改变方法裂解-分离-检测裂解：化学法-溴化氢（Met羧基端，酸性条件）；5，5-二硝基苯甲酸（Cys,pH8.0）；酶法-专一性蛋白水解酶胰蛋白酶：碱性aaArg和Lys羧基端，对Arg-Pro,Lys-Pro健无作用胰凝乳蛋白酶：芳香族aa羧基端，内肽酶：Lys羧基端；V8蛋白酶：酸性aaAsp和Glu羧基端（PBS，pH8.0），Asp-X（乙酸BS，pH84.0）梭菌蛋白酶：Arg羧基端，凝血酶：专一裂解Arg-Gly键胃蛋白酶：肽段分离：HPLC：C18C8HPCE：胶束，聚焦，区带，凝胶模式，SDS-PAGE：15%胶浓度，Tricine-三甲基甘氨酸，肽段检测：紫外检测器214nm肽图谱质谱检测器肽段分子量质量肽图重组人胰岛素及其类似物理化性质人胰岛素甘精胰岛素门冬胰岛素赖脯胰岛素地特胰岛素谷赖胰岛素生产企业多家企业Aventis公司丹麦NovoNordisk公司美国Lilly公司丹麦NovoNordisk公司Aventis公司商品名多种来得时Lantus诺和锐NovoRapid优泌乐Humalog诺和平Levemir艾倍得Apidra分子式C257H383N65O77S6C267H404N72O78S6C256H381N65O79S6C256H381N65O79S6C267H402N64O76S6C258H384N64O78S6分子量5807.6960635825.85807.585916.95823等电点5.46.75.15.45.45.1起效时间速效长效长效速效长效速效人胰岛素与胰岛素类似物肽图分析人胰岛素V8酶切位点示意图人胰岛素及其类似物的RP-HPLC肽图谱1.片段Ⅳ2.片段Ⅲ3.片段Ⅱ4.片段Ⅰ5.片段Ⅰ和Ⅳ的聚合等电聚焦电泳分析材料，试剂及仪器等电点标准蛋白、凝胶支持膜（GelBondRPAGfilm）、电泳电源（EPS3500）、恒温水循环器（MultiTempII）、水平电泳槽（MultiphorII）均为Pharmacia公司产品；电泳玻璃板及其固定装置（Bio-RadMini型）。实验方法溶液的配制丙烯酰胺贮液(10%)；过硫酸铵溶液(10%AP)；电极液阴极液：1mol/LNaOH；阳极液：1mol/L磷酸。甲基红指示液；固定液；脱色液；染色液考马斯亮蓝G0.1g，加脱色溶液100ml。等电点标准蛋白溶液的制备取一小瓶等电点标准蛋白，溶于100μl无离子水中，4℃存放待用。样品溶液制备取rhbFGF脱盐样品适量，用水配成3mg/ml的溶液。取此溶液90μl加Amphline10μl，甲基红指示液2μl，混匀备用。凝胶的制备玻璃板的处理将水平制胶模具中的小玻璃板一面加几滴硅烷化试剂，用擦镜纸均匀涂布于玻璃板表面，室温放置干燥后，用无离子水冲洗表面，去掉水滴，备用。制胶将凝胶支持膜疏水面一侧紧贴在大玻璃板上，膜两侧边缘放置隔片带(0.5-0.7mm)，将小玻璃板硅烷化处理的一面朝膜放在隔片带上，固定。凝胶液(丙烯酰胺－无离子水－载体两性电解质＝6.3－4.5－1.2)经充分脱气处理后，加10％AP和TEMED(0.03：0.06)，混匀，沿平板一端灌入，勿使产生气泡，凝胶凝固后，去掉玻璃板，待用。预电泳将制好的胶铺在电泳槽内冷却板中央，4℃预冷30分钟。将电极条分别用阴、阳极电极液充分湿润，去掉多余电极液后，平行置于凝胶两端。电极垂直平置于电极条上，保持适当的压力。200V，预电泳20分钟。加样先将滤纸片（0.5cm×0.5cm）排放在距阴极端2或3cm处，分别样品液、标准液各10μl加在滤纸上。电泳先200V恒压电泳20min后，恒流8mA，电压升至550V后，再恒功率12W电泳，当电压升至1200V时，停止电泳。固定与染色将胶片置于固定液中1小时，取出置脱色液中平衡30分钟，再置染色液中20分钟，最后将胶片置脱色溶液中直至本底透明。2.2凝胶的制备等电聚焦方法学的考虑等电聚焦分析的条件凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。常用两性缓冲离子建立载体两性电解质pH梯度；或是将缓冲基团成为凝胶介质的一部分即固相pH梯度。后者灌胶技术比较复杂，电泳时需要高电压，且电泳时间长。原理在支持介质中放入载体两性电介质，通以直流电后，在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度。当带电的蛋白质分子进入此体系时，移动并聚焦于相当其等电点的位置。由此可见，IEF是依照等电点的不同将蛋白质分子分离。根据蛋白带在pH梯度中的位置可测得该蛋白质的等电点。等电聚焦实验条件的考查支持介质在分析IEF中常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶作为支持介质。前者适于分析分子量小于30万蛋白质，后者适于分子量大至200万的大分子。我们用聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，并考查了凝胶浓度为3％、5％、9％和交联度为3％时对结果的影响，实验中发现，3％胶太软，难操作，而9％胶又较硬，易断裂，结果以5％T较合适。载体两性电介质是IEF最关键的试剂，它直接关系到pH梯度的形成以及蛋白带的聚焦。我们比较了市售产品Ampholine(LKB)、Pharmalyte(Pharmacia)和国产Ampholine国产的试剂在有效期内使用可以达到国外同类产品的效果在凝胶和样品溶液中，载体两性电介质的最适浓度为10％。阳、阴极电极溶液作用是为了避免样品或载体在阳极氧化或在阴极还原。电极液的选择会影响最终的pH梯度，特别是在靠近电极条位置。我们比较了1mol/L的磷酸－乙二胺、NaOH-HPES、NaOH-H3PO4电极液，结果以NaOH-H3PO4为最适。盐离子干扰pH梯度的形成并使蛋白带畸变。有些离子还会产生高电流而导致烧胶样品中有盐（大于0.1mol/L时），应先脱盐。样品加样位置影响聚焦效果，采用滤纸片加样法可把样品加在凝胶上不同的位置，对碱性蛋白而言，应靠阴极加样，即两电极距离的1/3处，有助于蛋白快速聚焦。pH梯度和pI的测定平板电泳胶可以用表面电极或等电点标准蛋白测定pH梯度。但前者需要昂贵的表面电极和pH计，操作麻烦，干扰因素多，常采用等电点标准蛋白测定pH梯度。以蛋白迁移距离为横座标，等电点为纵座标，绘制pH梯度曲线。由样品的迁移距离即可求出其pI值。线性回归方程为y=－1.2593x+10.808γ=0.9939。由IEF图谱可见rhbFGF样品聚焦在9.3附近，由pH梯度曲线得到的等电点为9.4（n=5，RSD%=1.0%），与文献值(pI=9.6)相比,重组rhbFGF的等电点偏低，这可能是因为重组rhbFGF含有17个氨基酸的融合蛋白，使其组成与天然hbFGF有差别。rhbFGF的IEF图谱（见图1），pH梯度曲线（见图2）。rhbFGFIEF图谱Lane1,2,3：rhbFGF样品Lane4：等电点标准蛋白0246810120246迁移距离等电点pH梯度曲线3.504.555.205.856.556.857.358.158.458.659.3rh-PTH(1~34)的IEF电泳结果ResultoftheIEFgelelectrophoresislane1:pImarkerpH3.5-9.3lane2:standardofPTH(1~34)lane3~5:samplesofrh-PTH(1