酵母双杂实验原理及技术

1蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA文库研究蛋白相互作用第一部分系统简介1.实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录活化结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和Gal4系统两种。在LexA系统中，DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录;在Gal4系统中，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GALUAS结合，只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GALUAS结合并且引起报道基因的转录。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4UASs和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理AH109（Trp,Leu,His,Ade表达缺陷株）pGBKT7KanrTrp1GAL4BDbaitpACT2AmprLeu2GAL4ADcDNApGBKT7-baitpACT2-cDNAUASPromoterMel/Ade/His/LacZreportergeneGAL4DNA-BDGAL4ADBaitproteincDNA:protein22．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选cDNA文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。3．酵母双杂交GAL4系统筛选cDNA文库实验流程构建DNA-BD与钓饵DNA融合的重组质粒构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母菌AH109检测钓饵蛋白自身激活能力文库DNA转化含有DNA-BD载体的酵母菌AH109阳性克隆在X-α-Gal平板上的初步筛选酵母中质粒的提取及PCR酶切分类酵母质粒电转化大肠杆菌KC8，抽提分离所需质粒所得质粒与构建于DNA-BD载体的目的DNA再次共转化酵母菌AH109阳性克隆在X-α-Gal平板上的再次验证，质粒纯化、测序。34．GAL系统所用酵母菌株与载体1).GAL系统所用酵母菌株注：菌株AH109可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1三个报道基进行筛库。菌株Y187可利用所带的IacZ报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。菌株CG-1945可被用于用环己酰亚胺来分离BD-bait和AD-library质粒。2).GAL系统所用各种质粒4第二部分实验流程构建于AD载体的cDNA文库的扩增一．培养基：LB液体培养基，121℃，15lbf/in2灭菌15minA．bacto-Tryptone10.0gB．bacto-YeastExtract5.0gC．NaCl5.0gD．5NNaOH调pH→7.0E.ddH2O→1000.0ml*LB固体培养平板为含有1.8％琼脂（Agar）的LB培养基LB/Amp培养基为含有Amp100ug/ml（高压后冷却到50℃加入）的LB培养基二．实验步骤：1.自-70℃冰箱取出含有DNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻；2.用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释；3.取稀释菌液各10ul加入90ulLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(φ90mm);37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr,计数平板上单克隆菌落数；4.确定待扩增的DNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)；5.按照2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板(φ150mm)，共100块；37℃倒置培养过夜；6.在超净台上，将所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000mlLB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr;7.留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-70℃;8.其余培养菌液8000rpm×10min,4℃，收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。5构建于AD载体的cDNA文库的纯化一.试剂：质粒DNA提取缓冲液名称缓冲液配方P1悬浮缓冲液50mMTris-Cl,pH8.0;10mMEDTA;100ug/mlRNaseAP2裂解缓冲液200mMNaOH;1%SDSP3中和缓冲液3.0MKAc,pH5.5QBT平衡缓冲液750mMNaCl;50mMMOPS,pH7.0;15%异丙醇;0.15％TritonX-100QC洗涤缓冲液1.0MNaCl;50mMMOPS,pH7.0;15%异丙醇QF洗脱缓冲液1.25MNaCl;50mMTris-Cl,pH8.5;15%异丙醇二.实验步骤：1.培养菌液离心6000rpm×10min，4℃,每500ml的培养物的沉淀重悬于50mlP1缓冲液;2.加入50m1P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min;3.加入4℃预冷的50mlP3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min(其间再倒置混匀4-6次);4.将上述混合液再倒置混匀，离心12000rpm×30min,4℃，保留上清；5.上清再离心12000rpm×15min,4℃，留上清；6.将上清液上样于经35m1QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱；7.以100mlQC缓冲液洗涤层析柱2次；8.以35m1QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA；9.以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500rpm×30min，4℃，小心去除上清；10.以7m170％乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500rpm×10min，4℃，小心去除上清；11.将沉淀的质粒DNA溶于5mlTE，pH8.0缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；l/10体积3.0MNaAc，pH5.2，于-20℃静置过夜；12.离心12500rpm×20min，4℃,去除上清，沉淀用70％乙醇洗涤，超净台风干；13.干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200ug/管(用于1次转化反应，约40ul)，保存于-20℃。6pGBKT7/bait小规模转化酵母菌AH109一.试剂：1.培养基：YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)A.YPD(Clontech公司)15.0gB.0.2%Adenine4.5mlC.ddH2O→300.0mlSD/-Trp固体培养基，(121°C，灭菌15min)A.SDAgarBase(Clontech公司)4.67gB.10×DO(-Leu-Trp)(Clontech公司)10.0mlC.20×Leu5.0mlD.ddH2O→100.0ml铺5块平板(90-100mm)2.其它贮备液：50%PEG4000(Sigma公司,wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌;100%DMSO(Sigma公司);10×TE:0.1MTris-HCl(pH7.5)，10mMEDTA，高压蒸汽灭菌;10×LiAc:1MLiAc用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌;10×Dropout/-Trp-Leu溶液:3.2gDOSupplement(-Leu-Trp)溶于500mlddH2O中;20×Leu:200mgL-Leucine(Sigma公司)溶于100mlddH2O中;0.2%Adenine:0.2gAdenineHemisulfateSalt(Sigma公司)溶于100mlddH2O中;ddH2O:高压蒸汽灭菌;二.实验步骤：1.从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3mm的AH109单克隆，接入1mlYPDA液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50mlYPDA液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD6001.5；2.取适量过夜菌液接种于300ml新鲜的YPDA液体培养基，至OD600=0.2-0.3，30°C恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6(约3hr)；73.室温离心2500rpm×5min，弃上清；加入25-50mlddH2O或TE重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5ml1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞（若仅用于转染质粒，则可置于4°C可几天内使用）；4.准备下列试剂：2×转化反应10×TE10×LiAc50%PEGddH2OA.1×TE/LiAc1.50ml150ul150ul/l.20mlB.PEG/LiAc1.20ml120ul120ul960ul/C.1×TE1.00ml100ul//900ul5.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀：pGBKT7-bait0.1ugSpermDNA*(10mg/ml)0.1mg*SpermDNA新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C6.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀；7.各加入600ulPEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm振荡培养30min；8.各加入70ulDMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min，迅速插入冰浴冷却1-2min；9.室温离心14,000rpm×5sec，尽量弃尽上清，以0.5ml1×TE重悬沉淀细胞，取100ul涂布SD/-Trp固体培养板，30°C倒置培养3天待菌落长出。8钓饵蛋白自身激活报道基因的活性检测—pGBKT7/bait与pACT2小规模共转化酵母一.试剂：1.培养基：YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)A.YPD(Clontech公司)15.0gB.0.2%Adenine4.5mlC.ddH2O→300.0mlSD/-Trp-Leu固体培养基，(121°C，灭菌15min)A.SDAgarBase(Clontech公司)4.67gB.10×DO(-Leu-Trp)(Clontech公司)10.0mlC.ddH2O→100.0m