2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体4

2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体植物体细胞杂交的意义：打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。一、动物细胞融合有些细胞的融合是正常的生命活动。如精子与卵细胞的结合。两个细胞正在融合受精作用(一)动物细胞融合的概念动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。（二）动物细胞融合的过程与植物原生质体融合原理相同，方法类似。杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。细胞A细胞B杂交细胞灭活的病毒物理法化学法用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的•为什么灭活的病毒能作为诱导剂？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。•不灭活的病毒能作为诱导剂吗？不能，因为不灭活的病毒会感染细胞。动物细胞融合技术的发展简史(三)动物细胞融合的应用1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能。2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。3.为制造单克隆抗体开辟了新途径。鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡、人—胡萝卜等主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振动、电激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较二、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞（浆细胞）能产生抗体。（一）获得抗体的传统方法1、把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。2、缺点：产量低，纯度低，特异性差。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念用单个B淋巴细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体就叫做单克隆抗体。2、怎样才能获得单克隆抗体？提示1：仅用细胞培养技术可行吗？提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？如何大量生产单克隆抗体？•利用B淋巴细胞产生抗体的功能。•利用肿瘤细胞无限增殖的特性。•利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。•利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。（二）单克隆抗体的制备整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。单克隆抗体的概念：由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养或注射到小鼠腹腔单克隆抗体为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。（三）单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体特异性强，灵敏度高，并可大量制备。应用主要有：1、作为诊断试剂2、用于治疗疾病和运载药物准确、高效、简易、快速把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成“生物导弹”。资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。思考与探究1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。1．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A．结果是相同的B．杂种细胞的形成过程基本相同C．操作过程中酶的作用相同D．诱导融合的手段相同Ｂ练习2.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C知识拓展1.体细胞核移植与线粒体DNA目前出生的克隆动物，没有与核供体动物完全一样的，如在毛色花纹上就会有微细的差异。对多利羊的研究发现，其核外的少量DNA，即线粒体中的DNA来自于受体卵母细胞，而不像其他DNA一样来自于供体核。法国某研究中心最近指出，现有的核移植技术普遍重视细胞核中的DNA，而忽视细胞质中线粒体DNA的作用，因此无法真正克隆出一模一样的动物。该研究中心对实验鼠进行了12年的研究，发现细胞核DNA并非包含机体全部的遗传信息，其细胞质中线粒体DNA在机体某些遗传特征方面也起重要作用。细胞核含有成千上万的基因，细胞质线粒体DNA只含有不到50个遗传基因。该研究中心发现用目前普遍采用的体细胞核移植方法得到的克隆鼠的行为有时和体细胞核供体鼠完全不同，但若将线粒体DNA也移入去核卵母细胞，克隆鼠与其体细胞提供者的行为就基本一致了。这说明线粒体DNA对动物大脑的发育和行为都有直接影响。知识拓展2.已成功的动物细胞融合实例还有哪些？需经常查阅更多科研报道。生物种类细胞来源成功年代酵母菌—鸡原生质体—血红细胞1975年人—胡萝卜腹水癌细胞—原生质体1976年人—小鼠纤维肉瘤细胞—畸胎瘤细胞1978年知识拓展3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。知识拓展4.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。知识拓展5.对称融合与非对称融合细胞融合在植物上可以克服有性杂交的不亲和性，打破物种之间的生殖隔离，是扩大遗传重组范围的一种有效手段，也称之为体细胞杂交，由此再生出来的植株是体细胞杂种。进行细胞融合的方式有两种：一是将两个物种的细胞除去细胞壁后，将完整的原生质体融合在一起。在融合的细胞中含有两个细胞核和两种细胞质，这种融合方式叫做对称融合（symmetricfusion）。对称融合往往由于细胞核分裂不同步而产生染色体排斥丢失，同时也由于两个物种的全套基因组合在一起，好坏基因共处于一个杂种中，往往需要多次回交才能除去杂种中的不利基因，耗时长，效率低。为了较好的解决对称融合所带来的问题，产生了另外一种融合方式──非对称融合（asymmetricfusion）。非对称融合是指融合双方的亲本一方为完整的原生质体（包括细胞核和细胞质），而另一方只有部分染色体和细胞质，或者无染色体只有细胞质。这种融合方式可以较好的减少不利基因的重组，所得杂种只需要数次回交就可以达到改良作物的目的，耗时短，效率较高。除去染色体的方法可以用γ射线、χ射线、紫外线等物理方法，也可以用纺锤毒素等化学方法。知识拓展6.单倍体的诱导方法及应用价值单倍体（haploid）是指具有配子染色体数目的个体。单倍体可以自发产生，也可以诱发产生。动物中（除蜜蜂、白蚁等外）的单倍体，由于生理上不正常，在胚胎发育时期就会死亡。植物上自发产生单倍体的植物很多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麦、小麦、油菜等，共有约10个科26个属36个种的植物可以自发产生单倍体。除了自发产生单倍体外，人工诱导产生单倍体的方法有：（1）种间和属间杂交。由于远缘杂交，虽然不能受精，但在远缘物种的花粉诱导下，卵细胞可以在未受精情况下发育成胚，这种情况在马铃薯、大麦、小麦、玉米中都可以发生；（2）物理和化学诱变。花粉经射线照射或化学药品处理失去受精