植物检疫学植物检疫性细菌病害

第六章检疫性细菌病害植物检疫性病原细菌的检验方法梨火疫病FireBlight玉米细菌性枯萎病Stewart’sbacterialwiltofcorn柑橘黄龙病CitrusYellowshoot椰子致死黄化病CoconutLethalYellowing复习思考题植物病原细菌检疫检验技术•直接检测：直观检验和生长检验•间接检测活菌检测免疫吸附分离法噬菌体检验非活菌检测血清学检测1、活菌检测•分离培养法：营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌•浓缩接种及离体叶检测：提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。例如：浙江大学等在1％灭菌水琼脂中加75×10－6的苯并咪唑，做平板，加感病植物叶片，针刺＋摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。主要应用于水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。2.免疫吸附分离法•原理：接合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。•方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法平皿免疫吸附评价测定法简略流程如下：常用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油作包被洗涤液使用包被缓冲液3.噬菌体检验•原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞，在液体培养时，会使浑浊的细菌悬浮液变清，在固体平板上培养，则出现许多边缘整齐、透明光亮的噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。4.非活菌检测•非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些方法，前9种血清学方法，均属非活菌检测。它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至是无症感染组织的检测。5.血清学检验•原理：•方法：酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫荧光抗体法•免疫荧光抗体法：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗体反应，形成有荧光标记的抗体—抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察到黄绿色荧光。梨火疫病Fireblightofpear分布：1878年首先由burrill描述，在纽约发生，后由Erwin命名，是第一个被确定的植物细菌病害。主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约40多个国家。梨火疫病的地理分布寄主：梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李等４０多个属220多种植物，大部分属蔷薇科Pomoideae亚科。危害性：仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树发病后可在几星期内死亡症状：侵害花、果实、枝条和叶片。①花:侵染后变深褐色，枯萎。②叶片:从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。③嫩稍:先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。④果实：病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，初乳白色，后红褐色。⑤病枝:叶片凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，故称火疫病。⑥伤口：初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株死亡。Advancedfireblightonfruit-notebacterialoozeonfruit.Fireblightinnurserystock主要鉴定特征：梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成５个阶段。（1）花枯萎：侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。病菌可扩展至花梗及花簇中其它的花；在温暧潮湿条件下，花梗上有菌脓渗出。随着枯萎发展，花梗、花等变褐至黑褐色，条件适宜时可继续侵染杀死小枝并形成小溃疡斑。（2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。初症是在复活的溃疡附近的健康树皮组织上出现窄的水渍状区，几天后，树皮内部组织出现褐色条斑，随后病菌侵入附近繁殖枝内部并引起萎蔫死亡。这些枝条特别是嫩枝与下面谈及的枝枯萎有明显区别，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黄至桔黄色）。（3）枝枯萎：细菌直接侵入前1～3叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。初症是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，象拐杖状。条件适宜时，几天内可移动15～30cm，造成整枝死亡，病枝、枝皮、叶通常变黑。潮湿时，枝条上出现菌脓。后期，终芽前出现的枝枯萎一般不会萎蔫，且仅在枝最上部出现坏死。随着病菌不断深入，并侵染主干，皮层收缩，下陷，形成溃疡斑。（4）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。（5）损伤枯萎和砧木枯萎：这二种比较特殊，前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种EMAL-26、EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。病原菌：学名：Erwiniaamylovora（Burrill）Winslow异名：MicrococcusamylovorusBurrilBacillusamylovorus(Burrill)TrevisanBacteriumamylovorus(Burrill)Chester分类地位：原核生物界(Procaryotes),薄壁菌门(Gracilicutes),肠杆菌科(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属(Erwinia)解淀粉欧文氏菌形态特征：直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.9-1.8×0.6-1.5µm，多数单生，有时成双或短时间内3-4个呈链状。革兰氏染色阴性。在蔗糖培养基上27℃下培养3d，菌落直径3～4mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。生物学特性：兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，好气条件下利用葡萄糖产酸不产气，厌氧条件产酸缓慢。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。氯化钠浓度高于2％以上时生长延缓，至6％－7%时则完全抑制。抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。细菌生长的温度范围6～37℃，最适温度25～27.5℃，致死温度45～50℃，10min，最适酸碱度为PH6.0。梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，３天内在寄主植物组织中能达到109细胞，每个细胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。发病规律：病菌在病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是越冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田间操作将病菌传给健株。病菌亦通过伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。传播途径①近距离传播：雨水是果园短距离传播的主要因子，其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌以单个菌丝、菌脓或菌丝束被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内有77个属的100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200~400m。②远距离传播：主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。梨火疫病的远距离传播发生条件：受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。较高气温（18～24℃）和较高的湿度（70％以上）有利于病菌侵染。检验方法：1.产地检验：2.症状观察：梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会长期挂在树上3.分离培养可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。MS培养基菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方：琼脂20g，甘露醇10g，L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g，烟酸0.5g，MgSO4·7H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基钠0.1ml，0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml，0.5%中性红2.5ml，蒸馏水970ml，pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液1.75ml。CG培养基在29℃培养48小时后形成典型的火山口状菌落。配方：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放线菌酮20ml。4.致病性实验梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108cells/ml的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于１丈长的巴黎枝条，28℃下培养，一般10~12小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。1~3天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。5.血清学检验：免疫荧光、ELISA、ODD和凝集实验6.分子生物学方法：核酸探针和PCR技术检疫和防治1.严格检疫，禁止从疫区引入蔷薇科仁果类果树树苗。2.剪除病梢病枝。3.药剂防治：120mg/kg链霉素喷雾，或花期用波尔多液喷雾防治，效果很好。4.种植抗病品种：5.避免在低洼易涝地定植。芽前刮除发病树皮，在生长季节每隔7天检查1次各种发病新梢和组织，发现后及时剪除。对因各种农事操作造成的伤口都要进行涂药保护等。玉米细菌性枯萎病Stewart’sbacterialwiltofcorn分布：1889年纽约首先报道，现已20多个国家。分布于美国、加拿大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、、哥斯达黎加、波多黎各、圭亚那、秘鲁、巴西。寄主植物主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。危害：维管束病害、毁灭性病害。症状：整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹状不规则病斑，初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽1～10mm，严重时病叶萎蔫死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌溢脓。果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病籽粒变形、皱缩和变色。Necroticlesionsonmatureleaves;secondphaseofStewart'swiltdisease.病原菌：玉米细菌性枯萎病菌学名Pantoeastewartii(Smith)Mertaertetal.异名Erwiniastewartii(Smith)Dye；PseudomonasstewartiiSmith;Apalnobacterstewartii(Smith)McCulloch;Bacillusstewartii(Smith)Holland;Bacteriumstewartii(Smith)Smith;Phytomonasstewartii(Smith)Bergyeetal;Pseudobacteriumstewartii(Smith)Hrasil’nikov,1949;Xanthomomasstewartii(Smith)Dowson英文名Stewart’sbacterialwiltofcorn分类地位原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌属(Pantoea)形态特征：好气性短杆菌，两端钝圆，无