限制性内切酶

限制性核酸内切酶概念•限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。•主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。类似于DNA测序中的化学修饰法第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写第4个字母代表株最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性内切酶的类型根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子，可将目前已鉴定出的限制性内切酶一般将限制酶分为3种不同类型。•I型：切割位点不确定，不适用于基因工程。•Ⅱ型：基因工程的工具酶。•Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作亦无实用意义。首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离得到。I型限制性内切酶作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移动，在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的切口。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌Rd菌株中分离出来。作用原理：识别双链DNA上未甲基化修饰的一小段明确的序列（多数是回文序列），然后在识别位点之内的特定位置切割。II型限制性内切酶•一般性状对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用，•识别序列通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。•酶切切口齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端（不易重新连接）。粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’PstI的识别序列和酶切切口（粘端）CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTC同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’完全同裂酶不完全同裂酶XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤Y代表嘧啶。同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’能完全肯定的识别位点和切割位点，但切割位点也是在识别位点的一侧的一定距离，通常距特异性位点24bp-26bp。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGIII类限制性内切酶核酸限制性内切酶不同类型比较特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用途不大DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长酶催化反应的保温时间④扩大反应体积（20l）一般采取以下措施大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度4.DNA的分子结构DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA量高出很多倍。是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。5.缓冲液化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度Tris-HCl：维持pH二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：限制酶的用途•DNA重组•限制酶（物理）图谱绘制•突变分析（RFLP分析）•限制酶的部分酶切与完全酶切