霉菌酵母菌检测

LOGO指导教师：XXX食品中微生物的检测班级：XXX学生：XXX学号：XXXLOGOLOGO微生物检验的意义微生物检验是衡量食品和药品卫生质量的重要指标之一，是判定被检食品或药品能否食用或药用的科学依据之一。是判断食品和药品加工原料、生产环境卫生情况及对成品被污染的程度作出正确的评价，为卫生管理工作提供科学依据。微生物检验贯彻“预防为主”的卫生方针，有效的防止或减少食物中、药品毒害、人兽共患病的发生。保障人民身体健康。提高产品质量，避免经济损失。主要内容第一部分菌落总数的测定第二部分霉菌，酵母菌计数第三部分出口食品中大肠菌群，粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法第四部分金黄色葡萄球菌的检验一.菌落总数测定菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数，以CFU/g（mL）来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。一、实验目的1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。2、掌握平板菌落计数法及熟悉无菌操作技术。3、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。菌落总数测定器材与试剂：检样，无菌蒸馏水，平板计数培养基，1ml吸管，10ml吸管，无菌培养皿（17），镊子，试管（4），均质杯，剪刀，移液枪，报纸，量筒，烧杯，酒精灯，天平电炉、恒温培养箱、恒温水浴箱等。三、流程1、检样2、10倍系列稀释3、5个适宜稀释度各1mL,分别加入无菌平皿内4、平皿内倾注15～20mL琼脂培养基，混匀5、36±1℃培养48±2小时或（24±2）小时6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量7、计算菌落总数→报告四、步骤(一)取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样25g于225ml无菌水一起进入无菌均质杯内8000~10000r/min均质1~2min，制成1：10的均匀稀释液。2、用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成1：100的稀释液3、另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。5、稀释液移入平皿后，将冷却至46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，混合均匀。6、待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h（二）菌落计数做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。1、平皿菌落数的选择（1）选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。（3）当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。（三）结果与报告1、菌落总数的计算方法（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)式中：N―样品中菌落数；∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl―第一个适宜稀释度平板数；n2―第二个适宜稀释度平板数；d―稀释因子（第一稀释度）。（3）、若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（4）若所有稀释度平板菌落数均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。（5）、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。（6）、若所有稀释度均不在30～300之间，有的300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。2、菌落总数的报告（1）、菌落数在1～100时，按四舍五入报告两位有效数字。（2）、菌落数≥100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。（3）、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。（5）称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。六、注意事项1、无菌操作操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。2、采样的代表性如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。3、稀释液样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。5、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。6、倾注培养基的量规定不一，从12～20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察7、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。菌落总数测定几点说明由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）报告。菌落总数测定几点要求每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃放置，以便在计数检样时用作对照。原液10-110-210-310-410-51多不可计连片生长185030278000366001实验结果实验结果图片展示10-110-210-310-42.数据处理)/(44025100336678185gCFUg样品原液以及五个稀释度中原液、10-1菌落数目过多，10-3、10-4、10-5菌落数目过少，只有10-2为最适的稀释度。10-2稀释液的菌落数=所以每克柿饼样品中含菌数约为440CFU/g霉菌酵母菌计数霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。霉菌酵母菌菌落形态霉菌菌落形态：菌落呈绒毛状，絮状，蜘蛛网状。成熟的霉菌菌落多数有各种颜色的孢子形成，随种而异。酵母菌菌落形态：在孟加拉红琼脂平板上，多数为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色。少数表面粗糙或皱褶，有的菌落周边呈细分枝状。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。菌落外观与细菌菌落不易区别时，应挑取菌落，用水制片，置高倍显微镜下观察，其细胞个体比细菌大数倍，多为圆形或卵圆形，绝大多数为出芽繁殖。当平板内酵母菌菌落甚多时，常有酒香气孟加拉红（虎红）培养基培养出的霉菌实验流程稀释：1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。培养：倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。计数：选取菌落数10～150之间的平板进行计数。（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定1.实验数据记录如下项目序号稀释度及菌落数10-110-210-310-410-5霉菌计数11822002541203230000平均数152110酵母菌计数11453202112011371100平均数113110实验结果图片展示•10-110-2•。10-310-410-52.结果处理在10-1~10-5这五个稀释度中，10-1的生长状况较其它稀释度好，所以选取10-1进行计数.每克含霉菌菌落数=（25*10）/25=6(CFU/g)每克含酵母菌菌落数=（11*10)/25=5(CFU/g)（三）、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。大肠杆菌的生物学特性基本形态：此菌为两端钝圆的短