化学发光免疫分析技术资料

化学发光免疫分析技术齐振普2014.10.通许发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率化学发光剂和标记技术在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。一、化学发光剂能作为化学发光剂的条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。㈠直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。1.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。2．三联吡啶钌三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌电化学发光剂反应原理㈡酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。1．鲁米诺及其衍生物2．AMPPD1．鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺增强发光反应原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕1.碳二亚胺（EDC）缩合法二、发光剂的标记技术2.过碘酸钠氧化法3．重氮盐偶联法4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法1．发光剂的选择2．被标记蛋白质的性质3．标记方法的选择4．原料比5．标记率6．温度7．纯化与保存影响标记的因素化学发光免疫分析的类型用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析发光磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体冲洗后---夹心法（1）加入H2O2（pH10）（2）加入碱（pH10）直接化学发光的机理磁微粒模式图Y特点–抗原和抗体结合与未结合部分的易分离磁微粒技术化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。㈠辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。㈡碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。三、电化学发光免疫分析在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标本与相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图1.甲状腺激素2．生殖激素3．垂体激素和皮质激素4．贫血因子5．肿瘤标志物6．感染性疾病7．糖尿病胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素等。8．心脏标志物9．病毒标记物10．过敏性疾病11．治疗药物监测四、临床应用•发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。小结免疫化学发光的种类及主要不同点名称免疫荧光化学发光电化学发光简写FATCLIAECLIA原理发光剂经短波长的光照射后，由基态（低能级）跃迁到激发态（高能级），然后再返回到基态，并释放出光子。发光剂在化学反应过程中，吸收了化学能被激发，电子跃迁到激发态，再返回到基态并发光。以三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性电化学发光反应。名称免疫荧光化学发光电化学发光发光底物荧光素，罗丹明，铕（Eu3+）,4-甲基伞形酮1.直接化学发光（丫啶酯，三联吡啶钌）2.酶促化学发光（鲁米诺，金刚烷（AMPPD））三联吡啶钌名称免疫荧光化学发光电化学发光检测方式1.荧光抗体技术（固相荧光免疫分析）2.免疫荧光检测（①时间分辨荧光免疫测定，②荧光偏振免疫测定，③荧光酶免疫测定）1.直接化学发光（固相抗体+待测抗原+丫啶酯标记抗体+H2O2+NaOH→发光），光信号强度反映待测物浓度2.酶免疫发光(CLEIA)①固相抗体+待测抗原+辣根过氧化酶标记抗体+鲁米诺+H2O2+发光增强剂→发光，②固相抗体+待测抗原+碱性磷酸酶标记抗体+AMPPD→发光，光信号强度反映待测物浓度磁性微粒标记抗体+待测抗原+三联吡啶钌标记抗体复合物→流动池三丙胺（TPA）在电极表面发生电子转移→发光，光强度与待测抗原成正比名称免疫荧光化学发光电化学发光检测仪器荧光显微镜免疫荧光检测仪化学发光分析仪电化学发光分析仪名称免疫荧光化学发光电化学发光临床应用1.病理组织、细胞（淋巴细胞表面的CD抗原等），自身抗体（抗核抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体等）2.激素，肿瘤标志物等1.激素（甲状腺激素，性激素，胰岛素，C-肽，HCG等）2.肿瘤标志物（AFP，CEA，PSA，CA-199，CA-125，CA-153，CA72-4等）3.感染（衣原体抗体，支原体抗体，弓形虫抗体，风疹病毒抗体，巨细胞病毒抗体等）4.病毒标志物定量（乙肝，丙肝抗体，抗-HIV等）5.治疗药物检测（地高辛，茶碱，巴比妥等）名称免疫荧光化学发光电化学发光特点1.荧光抗体技术可以检测组织、细胞的抗体等。2.荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物作为放大系统，灵敏度大大提高。3.时间分辨荧光免疫测定灵敏度高，检出量可达10-18mol/L(普通荧光免疫技术只能达到10-8mol/L)；分析范围宽，达4～5个数量级；标记结合物稳定，有效期长；无放射污染等。1.化学放光酶免疫分析属酶免疫测定范畴，测定过程与ELISA相似，仅最后一步酶反应的底物改为发光剂和测定的仪器为光信号检测仪；2.梅标记抗原或抗体结合稳定；3.酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发出的光稳定，持续时间长，便于记录和测定。①三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子，可周而复始地发光，持续时间长，信号强度高，容易测定，容易控制；②三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标志物的理化特性；③试剂灵敏度高，稳定性好。