细胞凋亡与肿瘤

细胞凋亡研究进展IMICONFIDENTIAL古春博2014.09.01一、细胞凋亡的调节1.1抑癌基因p531.2原癌基因Bcl-21.3Fas抗原1.4c-myc1.5干扰素(IFN)1.6神经酰胺1.7中药诱导1.8氧自由基(ROS)二、细胞凋亡与肿瘤三、细胞凋亡与炎症四、细胞凋亡与自身免疫疾病五、细胞凋亡检测技术进展一、细胞凋亡的调节IMICONFIDENTIAL41.1抑癌基因p53细胞表面诱导因子刺激传入细胞内部触发内部死亡程序自然死亡正常调节：异常调节：导致发育异常或肿瘤发生p53分子警察监视基因组DNA正常：细胞正常繁殖，自然凋亡DNA异常：p53蛋白积累，DNA复制停滞其它分子修复DNA使之正常修复失败，p53通过凋亡引起细胞自杀，阻止细胞癌变如果p53发生突变，抑癌基因变成成癌基因。一、细胞凋亡的调节Bcl-2膜结合蛋白过度表达阻碍/延迟正常细胞分化细胞寿命延长细胞数目增多基因变异机会增加已阐明Bcl-2表达于：甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和大肠癌抗原一、细胞凋亡的调节Fas抗原分子在机体免疫系统中发挥重要作用。Fas单克隆抗体或Fas配体（FasL）与Fas结合可以诱导Fas+细胞凋亡，故Fas又称为死亡分子。Fas信号传导机制未名，但确信与T淋巴细胞分化调节、自身免疫病的发生、某些肿瘤的发生发展密切相关。Fas抗原介导的细胞凋亡可被p53、Bcl-2等调节。一、细胞凋亡的调节已阐明c-myc高表达于：乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等c-myc调控细胞增殖细胞功能正常：维持细胞分裂增殖外界信号改变基因受损细胞凋亡c-myc调控细胞的对立作用关键：生长因子存在与否存在：细胞大量分裂增殖缺乏：细胞进入凋亡状态干扰素（IFN）干扰素是细胞因子中的一个家族，是一种糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调控等多种生物学功能。IFN-α：抑制慢性B淋巴细胞白血病细胞凋亡抑制Burkitt淋巴瘤细胞凋亡IFN-γ：抑制人中性粒细胞凋亡干扰素也能促进某些细胞凋亡一、细胞凋亡的调节机理未完全阐明，可能是下列几点：①诱导蛋白激酶的激活：IFN-γ激活蛋白激酶C导致细胞凋亡②基因表达的改变：IFN-α下调非黑素瘤皮肤癌Bcl-2基因表达，抑制凋亡作用③改变跨膜信号：IFN-α诱导细胞膜跨膜受体Fas-R表达，而Fas-R/Fas配体系统介导细胞的跨膜凋亡信号传递，从而导致细胞凋亡。④磷酸化作用：IFN-β使胃癌细胞株TMK-1细胞中成视网膜细胞瘤蛋白磷酸化减弱，从而促进该细胞凋亡。神经酰胺Niemann-pick病人成纤维细胞经辐射后，细胞不发生凋亡；细胞转入酸性神经鞘磷脂酶（SMase，一种神经酰胺），细胞恢复对凋亡敏感性；酸性SMase基因敲除的小鼠全身辐射后，多个器官未发现典型的凋亡损伤。上述资料表明，神经酰胺是细胞凋亡的一个重要介质。一、细胞凋亡的调节中药诱导清热解毒类中药苦参碱：诱导肝癌细胞凋亡，可能与下调stat3、stat5，抑制JAK-STAT信号通路有关白花蛇舌草：诱导肝癌细胞凋亡，机制可能是激活p53、抑制Bcl-xL，影响细胞代谢半枝莲：诱导细胞凋亡，机制可能是上调caspase-3、下调Bcl-2和Survivin蛋白表达。鸦胆子油乳：将细胞阻滞于G0-G1期。青蒿素：青蒿素及其衍生物对肿瘤细胞有明显杀伤作用，与下调Bcl-2有关。扶正祛邪类中药人参皂苷：抗肿瘤血管生成；抑制Pim-3(丝/苏氨酸蛋白激酶家族)表达而阻滞细胞生长。黄芪(qí)：将细胞周期阻滞于G1期，与上调Bax基因有关。活血化瘀类中药姜黄素：与Bax和Bcl-2无关，而与与抑制细胞中HIF-1α蛋白表达有关。莪术(ézhú)：抑制COX-2和VEGF表达，诱导细胞凋亡。丹参酮：上调TGF-β1、COX-2及VEGF，上调p38、MAPK表达，诱导细胞凋亡。利水消肿类中药紫杉醇：扰乱有丝分裂，使细胞阻滞于G2/M期薏苡仁：主要与上调p53基因表达有关一、细胞凋亡的调节中药诱导以毒攻毒类中药As2O3：砒霜主要成分，长期被认为是一种致癌剂，抑制DNA和RNA合成，干扰细胞代谢，致染色体畸变。近年来，发现可抑制肝癌细胞，主要是启动Bcl基因、激活caspase酶、抑制端粒酶活性、上调p27kip1蛋白及下调Skp2和CDK2有关华蟾素：上调Bax表达有关斑蝥酸钠：下调Survivin和激活caspase-3有关守宫、白藜芦醇、吴茱萸碱、雷公藤、甘草黄酮也可诱导肝细胞凋亡，但凋亡率不超过35%。一、细胞凋亡的调节活性氧(ROS)一、细胞凋亡的调节氧：参与产生ATP的氧化磷酸化反应，维持生命所需的能量产生有害的氧自由基，造成细胞损伤并导致疾病和衰老。凋亡机制：①细胞异常时积累的ROS激活线粒体上非特异性的转运通道（PTP）开放，导致H+在膜两侧达到平衡以及呼吸链底物在细胞质与间质间达到平衡，呼吸作用无法持续进行，引起细胞凋亡。②ROS损伤线粒体DNA，并且这些损伤是可以遗传和积累的，过多的损伤将影响组织和器官正常功能，机体会启动细胞凋亡机制。③p53介导的凋亡中，ROS处于中心信号位置，引起Ca2+浓度上升，ATP缺失，跨膜电位降低，细胞凋亡。④ROS增加时，cytC侧漏到胞质可以导致细胞凋亡。二、细胞凋亡与肿瘤正常情况下，维持组织、器官正常形态和功能，将机体组成成分限制在生理需要的范围内凋亡信号下调，细胞可异常增殖，最终形成肿瘤。放射线或化疗药物杀伤肿瘤的机制实际上是诱导了靶细胞的凋亡过程。细胞被多种不利生物或(和)理化因素诱导时，可以通过细胞凋亡对抗肿瘤的发生；或者致癌因子通过抑制细胞凋亡促进肿瘤生长。三、细胞凋亡与炎症炎症反应是机体对有害刺激正常防御反应的一部分，也是组织损伤后修复的一个步骤。细胞凋亡与细胞坏死区别：细胞凋亡是主动过程，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。凋亡细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集，从其周围的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。细胞坏死被认为是因病理而产生的被动死亡，坏死的细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。IL-2和内毒素明显抑制细胞凋亡，IFN-α和氧自由基诱导细胞凋亡。细胞凋亡可以有效清除炎症细胞和增生细胞，否则会导致肉芽组织增生，引起器官破坏和功能障碍。四、细胞凋亡与自身免疫疾病细胞凋亡可以清除自身反应性淋巴细胞，以及免疫反应完成后失去功能的过量剩余细胞。如果细胞凋亡障碍，导致自身反应性T细胞清除发生障碍，继而发生自身免疫性疾病。动物实验证实，MRL-LPr鼠出生6个月时发生系统性红斑狼疮，可检测到Fas受体的突变，提示系统性红斑狼疮与Fas介导的细胞凋亡有关。另一重要机制：凋亡细胞最终依赖于吞噬细胞的吞噬作用。如果吞噬细胞未能识别凋亡细胞，凋亡细胞不能被及时清除，凋亡小体内丰富的免疫原性物质发生泄漏，激发自身免疫反应。形态学观察五、细胞凋亡检测技术进展①光学显微镜：细胞缩小、核质固缩聚集、形成小体及有吞噬现象。但不具有诊断价值（因细胞坏死与细胞凋亡形态相似）②荧光显微镜：早期凋亡细胞比正常细胞对台盼蓝、溴化乙锭等染料的摄取增加，但又不如凋亡晚起那样明显，所以，可以较好区分凋亡早期、凋亡晚起和正常细胞。③电子显微镜：可见细胞核核仁消失，染色体密集、集中于核膜内，甚至可以观察到凋亡小体的出现。④激光共聚焦显微镜：对凋亡细胞固缩染色质和核碎片进行定位。含量及降解分析五、细胞凋亡检测技术进展①凝胶电泳②DNA片段定量③原位标记法：细胞凋亡时，双链DNA形成断裂缺口，使3’-OH暴露，末端转移酶(TDT)可标记缺口端3’-OH。④流式细胞仪：可定性，可定量，简单、快速、敏感。凋亡细胞细胞膜通透性增加和固定剂的影响，降解的DNA不能完全封闭与细胞中，在洗染过程中DNA碎片从细胞内逸出。结合荧光的DNA可以被FCM检测到。细胞内组分检测五、细胞凋亡检测技术进展①相关基因及表达蛋白：利用原位杂交和免疫组化等手段检测Bax、Bcl-2、c-myc。P53等相关调控基因表达水平。②酶活性：凋亡早期caspase-3活化，检测之可了解细胞凋亡的程度和时间。③相关离子：激光共聚焦显微镜观察Ca2+、Mg2+,，了解细胞凋亡时的生理状态。④线粒体膜电位5.4细胞膜结构分析①细胞凋亡早期，磷酯酰丝氨酸(PS)从膜内迁移到膜外。用荧光标记与PS高度结合的膜联蛋白（AnnexinV），通过FCM识别凋亡细胞。②PI不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞，但能进入细胞膜破损的坏死细胞。因此，AnnexiV-FITC‒/PI‒代表正常细胞；AnnexiV-FITC+/PI‒代表凋亡细胞；AnnexiV-FITC+/PI+代表坏死细胞，并可计算比例。