1.2基因工程的基本操作程序

原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区:非编码区:原核细胞的基因结构有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列非编码序列：包括非编码区和内含子有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核终止子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用实现一种生物的基因在另一种生物中表达。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的基因2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成请阅读P9,了解：目的基因、基因文库的概念一、目的基因的获取1、从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（2）基因文库种类基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）（1）.基因文库基因文库的本质是含有某生物基因的菌体群（3）基因文库的构建①基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）②cDNA文库的构建与载体连接导入受体菌群mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA(cDNA)该生物cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组文库与cDNA文库的比较基因组文库与部分基因文库的关系（4）怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?根据基因的有关信息：如基因的核苷酸序列、基因在染色体上的位置、基因转录的mRNA，以及基因表达的产物蛋白质等。PCR—多聚酶链式反应原理：前提：条件：PCR扩增仪DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物（一对寡核苷酸序列，与目的基因的起始段互补）热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制2、利用PCR技术扩增目的基因5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ2、利用PCR技术扩增目的基因具体过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链不同点解旋方式场所酶温度条件合成对象联系PCR技术与DNA复制的比较解旋酶催化高温变性解旋细胞内主要在细胞核内细胞外主要在PCR扩增仪内解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐热的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行DNA分子DNA片段或基因模板、原料、酶、引物等均相同PCR技术DNA复制根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成3、人工合成法1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。寻根问底质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA二、基因表达载体的构建（核心）a.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。b.用_____________切断目的基因，使其产生______________。c.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶二、基因表达载体的构建（核心）质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种1.过程二、基因表达载体的构建（核心）两个切口获得目的基因科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果长成的植株，有了抗虫能力。资料:2.目的：3.组成：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的组成：①目的基因：②启动子：③终止子：④标记基因：外源DNA分子的有效片段。一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，是负责驱动基因转录出mRNA的。位于基因尾端，起终止转录的作用。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。目的基因启动子RNA聚合酶识别和结合部位驱动基因转录出mRNA终止子使转录停止标记基因为鉴别受体细胞是否含目的基因自我复制的起点①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子和终止子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等。课本P15思考与探究1：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？2、将生物的所有基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入受体受体细胞。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。寻根问底a.转化——b.方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法：三、将目的基因导入受体细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对多数单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体的DNA上转化过程:组织培养技术Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物常用的转化方法。（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因的表达载体取受精卵显微注射移植到子宫胚胎继续发育新性状动物三、将目的基因导入受体细胞早期胚胎培养3、将目的基因导入微生物细胞（1）常用法：Ca2+处理（2）常用菌：大肠杆菌（3）原核生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少（4）过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA三、将目的基因导入受体细胞受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法用Ca2+处理成感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。四、目的基因的检测与鉴定（一）分子水平1.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因提取受体生物全部DNA适当限制酶切割DNA片段用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已插入）分子杂交技术2.检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。3.检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术提取受体生物的蛋白质与相应抗体杂交显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）抗虫或抗病接种实验（二）个体水平例转基因抗虫棉：如棉铃虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如棉铃虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。检测—（分子检测）鉴定—（个体检测）①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因