2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体

2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体一、动物细胞融合又称为细胞杂交。指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（一）.动物细胞融合概念知识回顾植物体细胞杂交过程植物细胞A（番茄）植物细胞B（马铃薯）去除细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞脱分化愈伤组织杂种植株(番茄马铃薯)再分化1、植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？2、动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？4、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？酶解法，纤维素酶和果胶酶。无需，因为动物细胞无细胞壁。物理方法：离心、振动、电激；化学方法：聚乙二醇能；还可以利用灭活的病毒进行诱导5、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。一、动物细胞融合（二）.原理：细胞膜的流动性。（三）.促进细胞融合方法物理法：电激、振动、离心等化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的病毒（最常用）不同DNA的两个细胞灭活病毒诱导细胞融合融合后的细胞（杂交细胞）进行有丝分裂（动物细胞培养技术）（四）.动物细胞融合过程产生杂交细胞，即具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。（五）.结果最重要的用途是制备单克隆抗体。（六）.用途主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）生物：灭活的病毒物理（离心、振动、电激）化学（聚乙二醇）诱导融合方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合过程细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目（七）植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较•人们获得抗体的传统方法是什么?动物体内刺激抗体筛选单一浆细胞不能无限增殖产生大量抗体抗原浆细胞•这种方法的缺点是什么?产量低、纯度低，制备的抗体特异性差。血清二、单克隆抗体每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体体内产生的特异性抗体多达百万种如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体，又能大量繁殖的细胞骨髓瘤细胞能无限增殖+一个浆细胞只分泌一种特异性抗体设计方案：（一）.单克隆抗体的概念由单个B淋巴细胞（浆细胞）经过克隆形成的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。（二）.单克隆抗体的制备过程（二）.单克隆抗体的制备过程（二）.单克隆抗体的制备过程诱导融合选择培养基继续培养，筛选克隆能产生抗体的阳性细胞体外培养或小鼠腹腔内增殖动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞杂交细胞杂交细胞（B-瘤细胞）单克隆抗体杂交瘤细胞瘤-瘤细胞B-瘤细胞B-B细胞第一次筛选第二次筛选骨髓瘤细胞是癌细胞吗？有无限增殖能力（丧失凋亡机制，失去接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞。肿瘤细胞不等于癌细胞。1.动物特异性免疫2.分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。3.细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG）4.第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活）。5.第二次筛选：对已经选择性培养的杂交瘤细胞进行“克隆化培养”，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的即是所需要的杂交瘤细胞。6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。7.提取单克隆抗体。单抗的制备过程要点：2、为何要进行两次筛选？第1次筛选得到杂交瘤细胞（有多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。1、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体特异性强，灵敏度高，可大量制备。（三）.单克隆抗体的优点1、作为诊断试剂：具有准确、高效、简易、快速特点.2、用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）（四）.单克隆抗体的应用1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。诱导融合方法有所不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。1.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③2、1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”在一起，说明细胞膜。(2)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂，其遗传性状__。(3)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了_____________。具有一定的流动性有丝不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点3、下图表示单克隆抗体的制备过程，请分析完成下列问题：（1）A过程是从小鼠的脾脏取得细胞，该细胞能够产生。从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射类物质。能产生抗体的B特异性抗体抗原（2）B过程是一个过程，该过程的进行需要灭活的或诱导。C→D是过程，选出能产生特异性抗体的，继续培养。（3）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面与常规抗体相比，其特点是。细胞融合病毒聚乙二醇筛选杂交瘤细胞特异性强、灵敏度高，优越性非常明显。课件制作仙游第一中学黄美洪2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。例：已知细胞增殖时合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有种细胞。加入氨基喋呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的及其彼此融合的细胞不能增殖。人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？5骨髓瘤细胞