17-DNA重组技术

第十七章重组DNA技术与基因组学第一节DNA序列测定第二节重组DNA技术的基本操作原理第三节重组DNA技术的应用第四节基因组学和蛋白组学及研究技术简介DNA测序的基本策略设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。双脱氧末端终止法化学法测序技术进展+-MarkDNA测序的基本策略设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过高分辨率的电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，根据DNA片段长短排列顺序及其末端碱基就可读出待测DNA的碱基序列。双脱氧末端终止法化学法测序技术进展+-Mark有相同的起点,不同终点的一套DNA片段示意图电泳图谱双脱氧末端终止法测序原理酶反应电泳方向模板CCGGTAGCAACT3´5´GG5´3´引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3´5´TCAACGATGG5´3´读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGC双脱氧末端终止法（Sanger测序法）读出模板互补序列dNTP凝胶电泳较大片段较小片段ddGTPddATPddCTPddTTP反应混合物Klenow酶未知序列的单链DNA读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5´3´放射性标记的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3´5´CTGACTTCGACAA5´3´DNA的测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件DNA的化学测序示意图反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACGTACGT测序图谱TATTGCATTGTCTGCATTGTCT引物标记法测序(DyePrimer)一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP(terminator)终止法测序(DyeTerminator)一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。第二节重组DNA技术的基本操作原理重组DNA是基因工程的核心技术，即把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。一、DNA重组技术重要的工具酶二、重组DNA技术的基本操作原理一、重组DNA的重要的工具酶1、限制性内切酶2、DNA连接酶3、逆转录酶常用的DNA限制性内切酶的专一性酶辨认的序列和切口特点‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPTCPTTPPPGAPACPPPPOHGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'AGAACCTTG3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链反转录酶的三种催化功能依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶重组DNA技术基本操作原理ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的获取2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组体导入宿主细胞进行扩增5、筛选克隆细胞目的基因的获取1、建立DNA和cDNA文库2、体外扩增—PCR技术3、人工合成重组DNA技术路线—1基因文库(DNAlibrary)基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomiclibrary。cDNA文库（complementalDNAlibrary）将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA文库。基因文库和cDNA文库的建立可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA长度分级甲基化，双链接头DNADNA与载体连接引入大肠杆菌鉴定文库的滴度和特性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆组织DNA克隆的载体1、质粒2、噬菌体3、动物病毒4、植物寄生菌重组DNA技术路线—2重组DNA转移技术1、转化(transformation)：以质粒为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞的过程。2、转染(Transfection):以噬菌体或真核病毒为载体构建的重组体依靠对细胞的感染功能导入受体细胞的过程。3、电穿孔法(electroporation):高压脉冲电流使细胞产生临时的通透性以吸收DNA。4、微注射法(microinjection):借助极细针管的帮助把DNA注射入细胞核的方法。重组DNA技术路线—4电穿孔法示意图细胞壁原生质膜纤维素酶电穿孔细胞壁再生瞬间的开口外来的DNA插入外源DNA的植物细胞pBR322质粒的结构噬菌体感染大肠杆菌的途径噬菌体突变型作为克隆载体DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源DNA连接重组载体的体外包装带有外源DNA的噬菌体太小不能被包装反转录病毒的生活周期RNA衣壳被膜逆转录酶整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞丢失被膜丢失衣壳逆转录RNAcDNA转录转译RNA衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶植物冠瘿瘤（其表达产物帮助T-DNA转移和整合）鱆鱼碱Ti质粒结构编码两类酶：植物生长激素和细胞分裂素合成酶冠瘿氨基酸或冠瘿碱合成酶筛选克隆细胞载体特征的直接筛选菌落的原位杂交免疫学方法重组DNA技术路线—5pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活原位杂交法筛选DNA重组体图解用NaOH将菌体裂解，变性的DNA转移到硝酸纤维素膜上杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上将菌落复印至硝酸纤维素膜上重组DNA表达产物的免疫学检测32P-抗体裂解细胞，表达蛋白转移到硝酸纤维素膜上与放射性抗体杂交的蛋白质斑点转化到E.Coli细菌启动子插入的真核DNA片段放射自显影重组体Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography第三节重组DNA技术的应用一、产生新品种新选择转基因动植物构建微生物工程菌基因药物二、法医学的强大武器—DNA指纹法三、基因诊断和治疗胰岛素原的人工合成胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接转化E.coli胰岛素原Ti质粒为载体的植物基因工程I二元载体系统II共整合载体IIIT-DNA的转移与整合Ti辅助质粒Ti辅助DNA给体质粒Ti辅助DNA给体质粒pBR型质粒（给体质粒）宿主特异性外源基因宿主特异性整合带有外源基因的Ti质粒植物DNATi质粒转移并插入植物DNASouthern印迹法在DNA指纹法中的应用1DNA分子量标准物2犯罪嫌疑人13现场证据4犯罪嫌疑人21234Southern印迹法图谱Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜第四节基因组学与蛋白质组学及研究技术简介携带有细胞或生物机体的一整套遗传指令的核酸量称为基因组(genome)，在此基础上产生的基因组学(genomics)是一门在整个细胞、整个物种的基因水平研究DNA顺序、整个基因组成分和功能的科学。由一个基因组表达的所有蛋白质成分叫做蛋白质组（proteome），从整体水平研究蛋白质组的结构和功能即为蛋白质组学(proteomics)。一、基因组文库提供基因组特异的遗传信息目录二、多聚酶链式反应扩增特异性的DNA片段三、基因组测序提供最完善的基因文库四、序列和结构相关性提供蛋白质功能的信息基因组文库提供基因组特异的遗传信息目录DNA文库是是许多DNA克隆的集合，理论上基因组的所有DNA序列都能存在于基因组文库中。使用分子杂交的方法，可以在文库中找到先前已知的基因或顺序的位置，亦可用生物信息学（Bioinformatics）方法找出基因并研究其功能。在基因组文库中的已知顺序(称为标签顺序位点，sequence-taggedsite,STS)能够为基因组测序提供界标。多聚酶链式反应扩增特异性的DNA片段人类基因组工程以及对各种基因组测序的研究，为人们提供了前所未有的了解基因信息的好机会。这些DNA顺序信息又为简化单个基因的克隆以便更详细地进行生物化学研究提供了条件。