11DNA重组技术的基本工具_2

设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。1973年，美国科学家科恩将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达，创立了定向改造生物的新技术——基因工程。专题1基因工程从科技探索之路中可以看出：说明没有的研究成果，没有的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。阅读选修3《现代生物科技专题》的目录，找出现代生物科技包括哪些工程？基因工程、蛋白质工程、细胞工程、胚胎工程、生态工程基础理论技术•什么叫基因工程？基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。一、基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平新生物类型和生物产品剪切→拼接→导入→表达基因重组（定向）①它是一种按照人们愿望，定向改造生物遗传特性的技术。②在DNA分子水平上进行操作。③是在体外进行的人为的基因重组。④一旦成功，便可遗传。⑤主要技术是体外DNA重组技术和转基因技术。基因工程的特点：转基因抗虫棉抗虫棉普通棉•基因工程培育抗虫棉的简要过程：•上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？导入普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA形成关键步骤一：关键步骤二：关键步骤三：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来形成重组DNA重组DNA导入受体(棉花)细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——运载体（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶二、基因操作的工具切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要从原核生物中分离纯化出来的，迄今为止已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。（简称限制酶）限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。T磷酸二酯键1234512345AAATTGCCTTAAG识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的。4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”黏性末端平末端能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶限制酶•什么叫黏性末端？当限制酶在它识别的中心轴线两侧将DNA两条链切开时，切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫平末端？当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。DNA分子经限制性核酸内切酶切割产生的DNA片段末端通常有哪两种形式？有黏性末端和平末端两种。那么，在中心轴线两侧的双链DNA上的碱基有什么特点呢？不管是产生黏性末端还是平末端，在中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是旋转对称的。•要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就形成了重组的DNA分子了?实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。一种限制酶只能识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制酶的性质（专一性或特异性）决定的。中轴线思考：①限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是旋转对称的。②限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？问题探讨：①限制酶从哪里寻找？提示：联想以前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。②迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？是因为微生物在长期进化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵．将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子,是靠DNA连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条DNA链连接起来的酶，称之DNA连接酶。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coliDNA连接酶;另一类是从T4噬菌体中分离出来的,称为T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别：E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。（二）“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶磷酸二酯键DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。2、作用部位：基因工程中所用的连接酶有两种：一种是E·coliDNA连接酶。另一种是T4DNA连接酶。这两种连接酶都是连接双链DNA的缺口，不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？不是。⑴DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。⑵DNA聚合酶是以DNA一条链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的子链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。二者虽然化学本质都是蛋白质，但组成和性质各不相同。•外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？导入过程需要运输工具——载体。•载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”用什么方法才能将外源基因（目的基因）送入受体细胞中呢？质粒是基因工程最常用的载体。最常用的质粒是大肠杆菌质粒。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小双链环状DNA分子。质粒DNA上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。在基因工程使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。将外源基因送入受体细胞。1、作用：2、条件：⑴能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。⑵载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。⑶具有某些标记基因，便于进行筛选。⑷载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害。⑸载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作。3、常用种类：质粒、λ噬菌体衍生物和一些动植物病毒。（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.重组DNA不能复制，就可能丢失。2.没有一个至多个限制酶的切割位点，就不能进行DNA的重组。3.载体上没有没有标记基因，我们用肉眼又看不到载体是否真正进入，鉴定困难。4.载体必须对细胞无害。不能有害于受体细胞，影响其生命活动的正常进行。原因：•大肠杆菌的质粒：最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中含有标记基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素的抗性基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有影响，能在宿主细胞内进行复制。质粒的特点1、细菌拟核DNA分子外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒能在宿主细胞内进行复制。⑴能够在宿主细胞内复制并稳定地保存。⑵必需有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因插入其中。⑶必需带有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择（或筛选）。所有的质粒都可以作为基因工程的载体呢？⑷质粒的存在对宿主细胞没有影响。⑸大小应适合，以便提取和在体外进行操作。实际上天然质粒并不完全具备上述条件，要进行人工改造后才能用于基因工程操作。这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。注意：1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键C练习2.不属于质粒被选为基因载体的理由是（）A、能复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD