Module-5-相对定量：DDCT法和相对标准曲线法

Module5相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法2实时实时定量定量PCR:PCR:相对基因表达量相对基因表达量3目的基因:Plat1问题:处理我的样本后，Plat1基因的表达量有什么变化呢?未处理样本处理后样本示例实验示例实验4目的基因:Plat1问题:处理我的样本后，Plat1基因的表达量有什么变化呢?示例实验示例实验未处理样本处理后样本5目的基因:Plat1问题:处理我的样本后，Plat1基因的表达量有什么变化呢?示例实验示例实验未处理样本处理后样本6工作流程t=0t=12t=24t=48校正器timetotalRNAcDNAtotalRNAcDNAtotalRNAcDNAtotalRNAcDNA4-147ΔRnCyclesCt=14Ct=24ΔCt=24–14=10内对照目的基因目的基因与内对照的比较4-158ΔRnCycles内对照目的基因如果加入双倍的cDNA会怎样呢?ΔCt=23–13=10Ct=24Ct=14Ct=13Ct=239ΔRnCyclesCt=22Ct=27t=12hΔRnCyclesCt=24Ct=26t=24hΔRnCyclesCt=23Ct=33t=48hΔRnCyclesCt=23Ct=30t=0内对照目的基因比较Ct法4-1510两种相对定量的方法两种相对定量的方法比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法样本间的倍数关系样本间的倍数关系11两种方法的区别两种方法的区别??•没有标准曲线•简单,便宜,较高通量•额外的验证步骤•每个实验里的每个样品都要跑一条标准曲线•工作量大,费用大,较低通量比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法12ddCtddCt法的必要条件法的必要条件两个基因(目的基因和内对照)必须有相似的扩增效率!13ddCtddCt法的步骤法的步骤可以通过并列的跑两条扩增曲线，看它们是否平行来确定扩增效率.14检查指数增长期的曲线之间是否平行检查指数增长期的曲线之间是否平行内对照目的基因15更多数学的方法更多数学的方法.....16做两条标准曲线比较斜率做两条标准曲线比较斜率[cDNA]Ct目的基因内对照斜率=-3.38斜率=-3.3217标准曲线可以帮我们判断扩增效率标准曲线可以帮我们判断扩增效率•例如,斜率-3.3说明扩增效率接近100%.•更小的负值(例如-3.5)说明扩增效率小于100%.公式:E=10(-1/斜率)-118ΔΔCtCt验证试验验证试验[Template]Ct目的基因内对照ABCDEFGHIJ对应点相减A-F=ΔCt119对应点相减对应点相减Ct目的基因内对照ABCDHGEJIFA-F=ΔCt1B-G=ΔCt2C-H=ΔCt3D-I=ΔCt4E-J=ΔCt5[Template]20在在ExcelExcel中制作图表中制作图表ΔCt1ΔCt2ΔCt3ΔCt4ΔCt5A-F=ΔCt1B-G=ΔCt2C-H=ΔCt3D-I=ΔCt4E-J=ΔCt5ΔCt稀释点1234521根据斜率选择一种定量方法根据斜率选择一种定量方法比较Ct(ΔΔCt)法斜率≤0.1相对标准曲线法斜率≥0.122ddCtddCt反应板设置反应板设置对未知样本的目的基因和内对照进行real-time反应(每个样本三个重复).无模板对照(NTCs)–污染监测23ddCtddCt法的计算方法法的计算方法24ddCtddCt计算示例计算示例UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320显示出两倍的表达差异.重复样本Ct平均值25ddCtddCt计算示例计算示例UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320需要均一化数据从而去除样本间加样量不同带来的误差26ddCtddCt计算示例计算示例UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320通过Ct值相减:Ct目的基因–Ct内对照.需要均一化数据从而去除样本间加样量不同带来的误差27为什么为什么CtCt值要相减而不是相除值要相减而不是相除??•Ct值是指数值,而不是线性值.•因此,我们不能直接用Ct值相除.•用相减来比较Ct值.(例如:225÷220=25)28接下来接下来,,选择一个对照样本选择一个对照样本•所有其他样本都要和对照样本进行比较.•对照样本要便于样本间的比较.你不需要...Untreated:.074Treated1:.148Treated2:.222你需要...Untreated:1Treated1:2-倍增长Treated2:3-倍增长/.074/.074/.07429选择一个对照样本选择一个对照样本UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320首先,均一化对照样本本身(对照样本–对照样本).接着,所有样本和对照样本进行比较(未知样本–对照样本).30ddCtddCt最终倍数计算最终倍数计算UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320最终转化为倍数关系:2-ddCt.相对定量(RQ)值31ComparativeCtMethod步骤2:其他和样本校正器比较ΔCt样本–ΔCt校正器=ΔΔCt步骤1:内对照均一化样本差异Ct目的基因–Ct内对照=ΔCt步骤3:使用公式计算22--ΔΔΔΔCtCt倍数变化=4-1132公式含义?2CT2=循环间扩增产物量的倍数变化.(i.e.PCR扩增产物量倍增)ΔΔCT=样品和校正器之间校正过的循环数变化所以，这个等式告诉我们校正器和处理样本循环间扩增产物量的倍数变化4-1333•还记得开始时的dCt实验吗?•拿出计算器!!我们来算一下dCT34Samplec-mycAverageCtGAPDHAverageCtΔCtc-myc-GAPDHΔΔCtΔCttreated-ΔCtuntreatedFolddifferenceinc-mycrelativetountreatedTime030.4923.636.860.001.0Time=12hr27.0322.664.37-2.505.6Time=24hr26.2524.60Time=48hr32.8323.011.659.82-5.212.9637.010.1285???计算出一个小数点!用1/xkey得到正确结果:减少7.78倍!!3501020304050x-foldExpression5.637.011t=0t=12ht=24ht=48h-7.8Calibratort=0相对定量结果3675007500软件的优势软件的优势??为你完成所有的计算!37相对标准曲线法的计算相对标准曲线法的计算638当目的基因和对照的扩增效率不一致时使用当目的基因和对照的扩增效率不一致时使用TargetNormalizer-3.34-4.21Qty(Log)Ct39应该稀释什么样品来制作标准曲线应该稀释什么样品来制作标准曲线??•任何数量充足，并表达目的基因和对照基因的浓缩cDNA•只需知道稀释倍数,不需要知道浓度•养成好的制作标准曲线的习惯40每个基因得到一条标准曲线每个基因得到一条标准曲线18sInsulin10,00010001001016420.64171.410,0001000100101CtCtRelativeQuantityRelativeQuantityUntreatedCtTreatedCtUntreatedCt74.6TreatedCt202.341计算举例计算举例UntreatedQavg.TreatedQavg.Insulin18s74.6202.36420.64171.4÷÷NormalizedQ0.01160.0484选择一个对照:例如,未处理样本Reference÷Reference:0.0116÷0.0116=1Treated÷Reference:0.0484÷0.0116=0.42表达倍数差异42再一次再一次,,软件的优势软件的优势......为你计算好所有的倍数关系.43不想每次试验都跑标准曲线？不想每次试验都跑标准曲线？•另一个选择:你可以非常精确的一次检测每个基因的扩增效率…44不想每次试验都跑标准曲线？不想每次试验都跑标准曲线？•在后续试验里执行一个ddCtrun.645不想每次试验都跑标准曲线？不想每次试验都跑标准曲线？•分析时手动输入每个基因的扩增效率●最终的相对定量计算就会把每个基因的扩增效率考虑进去646Question?