DNA重组方法……课件四

7.022001年秋季7.02Fall2001RDMRecitation#41DNA重组方法……课件四安排第四天·araPCR分析会有什么样的结果？·计算AG1111细胞的转化率·用微量提纯技术提取质粒DNAaraPCR分析的结果·我们用第三天的琼脂糖凝胶电泳法检测我们做的9个PCR的结果。当你看这些电泳结果时记住它们所对应的实验，这和以前所做的连接、转化没有关系！·3个野生型菌株的PCR（1－3）应该能得到产物。你可以通过引物杂交的位置计算产物的预期分子量，在你们的实验手册后面的附录部分有ara操纵子的图谱。·最前面的3个突变体（4－6）的PCR产物是野生型PCR产物的类似物，他们均使用了一对设计好的扩增其中一个ara基因的引物，只有目的基因完整时这些PCR才有产物。如果一个转座子插入这个基因，引物和模板结合的位点的距离就会变远，就不会有产物。·最后3个PCR产物（7－9）使用一个特别的引物，这个引物结合在LacZ编码序列中，也就是转座子的起点。这个引物结合位点（相对于编码序列）比较靠后，而另一个引物总是和前面的3个ara基因中的一个对应的配对。这几个泳道的产物表明转座子插入对应的ara基因中。检测产物的大小可以知道转座子插入到基因中的具体位置。·一般的，对于突变株来说，也就是4－6和7－9PCR产物，彼此之间有很大的关联性。比如说，如果我们在第4泳道看到条带，我们在第7道就应该看不到，或者相反；如果我们在4，7道都看到了条带，或者4，7道都没有条带，则需要一些另外的解释。PCR分析的可能反常结果·野生型C－For/C-Rev的产物条带比A和B的弱。这是因为C的引物对的浓度比A、B的引物对的浓度低，这个问题我们希望在以后的实验中能得到改进。·PCR＃8出现一条明亮的带，而PCR＃5却只有一条较弱的带。这可能是由于PCR＃5被野生型DNA污染的缘故。·PCR＃6和PCR＃9都没有条带。如果转座子插入到AraC基因的位点非常靠近起点，这种情况就会出现。因为这种情况下得到PCR产物非常小，电泳中可能迁移出了凝胶的边缘，或者由于它没有结合足够的EB而不能呈现清晰的条带。·你觉得转座子插入到AraA基因中，但是你却在PCR＃8（AraB－For/LacZRev）中看到了条带。如果转座子在AraA基因中的插入位点特别接近AraB的引物结合位点的话，转座子和AraB之间的距离小于2500个碱基对，就会出现这种结果。为了理解这种情况怎么发生，可以画出Ara操纵子的结构图，标明引物的结合位点和他们之间确切的长度。计算转化效率·转化效率用一定条件下每微克DNA所得到的转化体的数目来表示。在做这些计算时，仔细思考转化的每个步骤，清楚所做的每步稀释！用克隆数目除以加到平板上的DNA的量（用微克表示），而不是在转化中所使用的总的DNA量！7.022001年秋季7.02Fall2001RDMRecitation#42用微量提纯技术提取质粒DNA·质粒DNA是小的、环状的、并具有超螺旋结构。质粒DNA和其他所有DNA一样能被高温变性，因为高温能破坏双链之间的氢键。然而，当温度降下来时，只有质粒DNA能够很快复性，因为它的双链在空间上彼此非常靠近。·这个方法就是利用质粒DNA的这个优点把它与染色体DNA分离开来。·基本思路：先加入去污剂和溶菌酶裂解细胞，然后沸水浴，这就会使所有的细胞内融物流出，并且使蛋白质变性，聚集成团。很粘的染色体DNA，会和其他细胞中的染色体的配对部分发生复性，导致一个巨大的粘的DNA铰链网络，也和成团的蛋白质聚集在一起。·当温度降下来时，质粒DNA由于其具有上面讨论的特性而迅速的复性在一起。因为它不会粘粘的聚在一起，所以还是水溶性的。·离心冷却的细胞裂解物，会得到清澈的上清液（包含质粒DNA，RNA和很多盐。盐是怎么出现的？答案是：EDTA）和小指管底部圆团状的物质。很多人喜欢叫它鼻涕。你可以随你的意。我们用无菌的牙签把它挑出来，就留下来富含质粒的上清液。·我们往上清液中加入异丙醇，这样就会增加溶液的疏水性，极性分子（比如DNA）具有彼此靠近脱离溶液而沉淀的趋势。对于DNA来说，这种沉淀趋势会被DNA主链所带负电荷的静电斥力而阻碍。增加溶液中阳离子的浓度，尤其是Na＋，可以克服这种阻力。·离心，沉淀的DNA（和RNA）就会和盐一起沉淀下来。我们需要除掉盐离子，因为它会抑制限制性内切酶的消化。·为了除掉盐离子，我们用80％的乙醇洗涤沉淀。由于这样的乙醇还有足够的极性，所以DNA仍是不可溶性的，但它已包括足够的水去除所有盐离子。·下一步，我们需要除去乙醇，它对于限制性内切消化也是个障碍。我们只要把样品放在温暖的房间（370C）20min左右就可以达到这个目的。在你确信已经除去了管中几乎所有的乙醇后，这个过程可以缩短。你可以用滤纸角吸去在你倾倒时仍留在小指管顶部的乙醇液滴。·最后，用含有RNA酶（分解RNA）的TE溶液重悬DNA沉淀，这样你就得到只有DNA的溶液，可以用来做限制性内切酶酶切分析。