最新-高效液相色谱法16-PPT文档资料

高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）前言:HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支，现已成为生化、医学、药物、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的分离分析手段。我国：开始仅为少数研究实验室拥有，现很多的生产、研究、质检部门。广泛应用于质量控制、分析化验、制备分离。例：讲课目的：入门教材问题：学习要求：课时安排：第一章：高效液相色谱的基本原理6学时第二章：高效液相色谱的仪器装置2学时第三章：液固、液液、键合相色谱4学时第四章：离子交换色谱和离子对色谱3学时第五章：凝胶渗透色谱1学时第六章：实验技术和辅助实验技术2学时机动2学时第3、5、7周实验参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用（色谱技术丛书、化学工业出版社、于世林编著)本课程基本要求：1.掌握色谱法的分类及有关术语；2.了解柱效的影响因素；3.掌握分离度的影响因素；4.了解定性、定量分析方法；5.掌握液相色谱仪的基本结构及功能；6.掌握常用的液相色谱法基本概念及分离对象7.掌握液相色谱的基本操作技能；第一章高效液相色谱法基本原理§1-1概述一.发展历史:100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法:Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法即:Chromatography(色谱法)色谱法的发展1906年正式命名20世纪30年代开始广泛研究和应用(柱色谱,薄层色谱→气相色谱)高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代现代液相色谱分析方法。经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器.二、色谱法概述混合物最有效的分离、分析方法。色谱法是一种分离技术。混合物分离过程：试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。一相固定不动，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过固定相的液体，称为流动相。高效液相色谱法的特性:高压、高效、高速、高灵敏。适用：高沸点、热不稳定样品液相色谱仪高效液相色谱仪流程图三、色谱法原理–混合物中各组份在不同的两相中溶解,吸附等化学作用性能的差异,当两相相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离–两相中一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),–一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),(洗脱剂,溶剂)分离原理:分离是一个物理过程。固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)当混合物进入色谱柱后，就在固定相、流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，理化性质不同，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数K有关：K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后流出柱子。mSccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度四、高效液相色谱法的特点高压以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，受到阻力较大必须对流动相施加高压。一般可达到150～300kg／cm2，甚至可达700kg／cm2以上。高速所需的分析时间较经典液体色谱少得多（交换速度快），流量可达l—10mL／min高效气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高（化学键合相），一般约可达6000理论塔板／米高灵敏度①紫外检测器的最小检测量可达(10-9g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。②所需试样很少；微升数量级高选择性可分离不同类型化合物和异构体，也可分析在性质上极为相似的化合物(同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）五、HPLC与GC区别1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、沸点低的样品，占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品.对分子量大、难气化、热稳定性差样品均可检测。占有机物的80%2．流动相的区别GC：流动相为惰性，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度.对分离起主要作用。3．操作条件差别4.分析样品区别GC：加温操作GC：破坏样品，不能回收HPLC：室温；高压HPLC：不破坏样品，能回收说明：气相、液相地位同样重要两种互补不足的色谱方法灵敏度：气相﹥液相应用范围：液相﹥气相六、色谱法的分类吸附色谱(AbsorptionChromatography)组分对固定相表面吸附力的不同而分离分配色谱(PartitionChromatography)组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离离子交换色谱(IonExchangeChromatography)组份离子交换亲和力的差异而分离体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)组分分子量大小不同,对固定相的渗透力不同而分离§１－２基本概念一、色谱图（chromatogram）检测器将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号。记录仪所记录下的浓度对分离时间的函数，称为色谱图。色谱过程特点：①浓度对分离时间呈高斯曲线型②色谱条件一定时，各组分都有一特定时间在图谱中出现，称为组分的保留时间。③柱效一定时，组分保留值越小，峰越窄；保留值越大，峰越宽。④相邻峰的保留时间相差越大，越易分离。常用术语：1.基线:仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。2.色谱峰:响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。(正态分布)3.峰高与峰面积：峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离用h表示。峰面积：峰与峰底之间的面积，用A表示。二、色谱保留1.保留时间（tR）从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间，用tR表示。2.分配系数K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比（单位：g/mL），称为分配系数，用K表示:MSccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。分配系数K的讨论一定温度下，组分分配系数K越大，出峰越慢；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；各组分有不同K值是分离的基础（差移速度）某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K3.容量因子k’(capacityfactor)一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。MSmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量’1.Ｋ与k’都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数,随分离柱温度、柱压的改变而变化2.Ｋ与k’都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.容量因子可以由实验测得。4.容量因子与保留时间的关系推导:ux：组分在分离柱内的迁移速度；u：流动相在分离柱内的迁移速度；,MSMSMk11mm11mmmwummmummmummmumsmsmssmmsmx组分和流动相通过长度L的分离柱，需要时间分别为tR和t0，则tR=to(1+k’)0oR'tttkk’太小---没有充分利用填料的分离能力k’太大---分析时间太长k’范围：１～１０k’∝1/ε0（ε0溶剂强度---使组分迁移快慢的能力）P310表3-10uLt;uLt0xR作业：思考题:1、2、3、4、5、6、8、95.选择性系数α可用来衡量两物质的分离程度，用α表示。1'R2'R1212''αttkkKK色谱理论需要解决的问题？色谱分离过程的热力学和动力学问题。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定相的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论。§1-3色谱柱的分离效率一、塔板理论塔板理论认为:一根柱子可以分为n段，每段内组分在两相间迅速达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则H=L/ＮＮ为理论塔板数。理论塔板数一N①色谱峰对称：说明：a.在给定的操作条件下，N几乎相同b.N为常量时，tw随tR成正比例变化c.与柱长有关:比较不同长度色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的N值。例d.是一种理想状态2WR)tt16(N②有拖尾峰时:可用半峰宽来表示N：N＝5．54(tR/W1/2)2W1/2-----半峰宽例：测得tR=105mm、W1/2=4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200.理论塔板高度HNLH2Rw)tt(16LH2WR)tt16(N物理意义：组分在两相间达到一次平衡对应的柱长H愈小→组分在两相间平衡分配次数越多→柱效↑（不能说明分离一定实现）说明：①Ｎ大，固定相分离潜能大。（分离与否，还取决于其他色谱条件）②一定色谱条件下，对k’有差异的组分，则柱效愈高，分离效果愈好。塔板理论的特点和不足：(1)当L一定时，N越大(H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效越高，所得色谱峰越窄。(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果：如两组分的分配系数K相同，无论该色谱柱的柱效多大，都无法分离。(3)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。二.峰扩展和速率方程式1.峰扩展--由于柱内柱外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成色谱柱效的降低峰扩展程度：取决于组分在柱内平衡分配次数例：引起峰扩展因素：柱内、柱外柱外因素①检测器流动池体积（尽量小）②柱出口到检测器的连接管（尽量短）③进样器死体积2.速率方程式（范·弟姆特方程式）H=A+B/u+C·uH：理论塔板高度，u：流动相流速(cm/s)。减小A、B、C三项可提高柱效。A，B，C三项各与哪些因素有关？A─涡流扩散项A=2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充得越均匀，A↓，H↓，柱效Ｎ↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u—分子扩散项B=2υDD：试样组分分子的扩散系数（cm2·s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差;(3)B/u与流速有关：流速↓→滞留时间↑→扩散↑(＞0.5ml/min)(4)扩散系数D，Ｄ↓→B值↓。液相中，分子扩散可忽略C·u—传质项传质—溶质分子在两相间浓度不同，由浓度高的相不断迁移至浓度低的相，直到浓度达到平衡。根据传质形式分：固定相传质和移动相传质C=（Cs+Cm）固定相传质原因：进出固定相速度不同（固相，液相）减小措施：①使用薄的固定相层，②小颗粒填料移动相传质：迁移滞留减小措施①填装均匀紧密②使用小颗粒填料和表面多孔性填料3.速率理论的要点:(1)柱内的峰扩展与涡流扩散、分子扩散、传质阻力有关。固液两相间的分配平衡不能瞬间达到是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、液膜厚度及流动相流速可提高柱效。(3)为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和填料对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约：流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；选择最佳条件，才能使柱效达到最高。4.获得高柱效的几种方法：①选用细的颗粒填料②流动相流速低③流动相粘度小④升高温度⑤溶质扩散系数与其结构有关ⅰ大分子，扩散系数小ⅱ小分子，扩散系数大5.影响分离的因素与提高柱效的途径•液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略不计，即H=A+Cu•降低传质阻力是提高柱效主要途径。•气相和液相Ｈ－ｕ区别§１－４分离度色谱分离目的：合理的时间内将