酵母双杂交protocol

3.1实验材料3.1.1菌株酵母菌株AH109，带有四个报告基因，ADE2，HIS3，MELI和lacZ，在三个不同的GAL4上游激活序列和TATAbox的控制下ADE2和HIS3提供了营养选择标记，可以减少假阳性克隆的机率：MELI编码α-半乳糖苷酶，当底物X-α-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色；lacZ编码β-半乳糖苷酶，当底物为X-Gal存在时，阳性克隆就会变成蓝色。该菌株具体特点见图3-1，3-2。图3-1酵母菌株AH109的报告基因图3-2酵母菌株表现型3.1.2质粒载体阳性对照质粒pGBKT7-53；阴性对照质粒pGBKT7-Lam；对照的AD质粒载体pGADT7-RecT均为clontech公司提供。HerringtestescarrierDNA（10mg/ml）购自invitrogen公司。载体信息见表3-1。表3-1本实验所用酵母双杂交载体信息3.1.2培养基⑴YPDA培养基Tryptone20g/LYeastextract10g1LAdeninehemisulfute30mg/LAgar20g/L定容至950ml，PH=5.8116℃高压灭菌15min，冷却至55℃时加入50m1过滤灭菌的40%的葡萄糖。⑵营养缺陷培养基（1L）YNB（Yeastnitrogenbasewithoutaminoacids）6.7g/LAgar20g/L根据不同的营养选择性培养基加入如下的dropoutSolution粉剂：SD/-Leu-Trp（二缺）：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入二缺粉剂0.64g/L。SD/-His-Leu-Trp(三缺)：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入三缺粉剂0.62g/L。SD/-His-Leu-Trp-Ade（四缺）：在不含任何氨基酸的SD培养基中加入四缺粉剂0.60/L定容到950ml，高压灭菌后加入灭菌的40%葡萄糖50ml，倒平板，于4℃保存。3.1.3主要试剂⑴1×TE/LiAc10×TE1ml10×LiAc1mlddH208ml合计10ml⑵1×PEG/LiAc（现配现用）50%PEG4000(polyethyleneglycol)8ml10×TE1ml10×LiAc1ml合计10ml⑶Zbuffer:Na2HPO4·7H2O16.1g/LNaH2PO4·H2O5.5g/LKCl0.75g/LMgSO4·7H2O0.246g/L⑷X-galstocksolution：X-gal溶于DMF中，终浓度20mg/ml。⑸Zbuffer/X-galsolution：Zbuffer100mlβ－ME0.27mlX-galstocksolution1.67m13.2实验原理实验原理见1.3.2。3.3实验方法3.3.1酵母菌株AH109感受态细胞的制备（LiAc法）⑴从-70℃冰箱是取出冻存的酵母菌株AH109，在YPDA培养基平板上划线，放入30℃的培养箱中倒置培养直至菌落直径长至2-3mm。⑵用接种环取新鲜的AH109单菌落1个，放入装有1ml液体YPDA培养基离心管中，涡旋打散菌落。⑶将打散的菌液全部转入含50mIYPDA液体培养基的250m1的三角瓶中，30℃230rpm条件下摇大约18小时.检测OD600大于1.5。⑷取浓度符合要求菌液大约25m1加入含300m1YPDA液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃230rpm继续摇大约3小时，使OD600在0.5左右。⑸将摇好的菌液加入50ml灭菌离心管，在室温下，3000rpm离心10min。⑹弃上清，用10m1的无菌水重悬细胞沉淀。⑺室温下，3000rpm离心10min。⑻弃上清，用1m1的1×TE/LiAc重悬细胞，备用。3.3.2酵母双杂交载体的共转化（42℃热激法）pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照。AH109划线二缺平板作为空载体对照。⑴预先取出鲑鱼精DNA（HerringtestescarrierDNA）于98℃变性10min，迅速置于冰上。⑵各取2ul质粒DNA和10ul鲑鱼精DNA，加入100ul酵母感受态细胞并混合均匀。⑶加入600ul1×PEG/LiAC，高速振荡均匀后30℃200rpm振摇30min。⑷加入70ulDMSO，轻轻混匀，置于42℃热激15min。⑸迅速置于冰上冰浴1～2min，3000rpm离心10min收集菌体。⑹悬浮菌体于300ul1×TE中，全部涂于二缺平板上。⑺待菌液充分吸收后，30℃倒置培养3～5天。3.3.3共转化阳性克隆的进一步验证pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照。AH109划线三缺、四缺平板作为空载体对照。⑴待二缺平板上生长出直径2-3mm的阳性菌落后，挑取阳性克隆于三缺平板上划线，并倒置于30℃培养3～5天，观察酵母菌生长情况。⑵待三缺平板上生长出阳性克隆后，同⑴挑取三缺平板上阳性克隆于四缺平板上划线，并倒置于30℃培养3～5天，观察酵母菌生长情况。3.3.4β-半乳糖苷酶显色反应检测lacZ报告基因pGBKT7-53和pGADT7-T共转化入AH109作为阳性对照。pGBKT7-lam和pGADT7-T共转化入AH109作为阴性对照。⑴自四缺平板上用无菌牙签挑取阳性克隆于新鲜四缺平板上活化培养3～4天。⑵准备浸泡于新鲜配置的Zbuffer/X-gal溶液的无菌滤纸及干燥的无菌滤纸。⑶将活化的阳性克隆用接种环取少量沾在干燥滤纸的相应位置，并做好标记。⑷将带有酵母菌的无菌滤纸放入液氮中冷冻10s，置于室温裂解15min。重复三次。⑸再将该滤纸置于被显色液浸湿的另一滤纸上，是菌落面朝上，室温孵育4～8小时，观察颜色变化，直至出现明显颜色为止。蓝色菌落即为lacZ+阳性克隆。