转录组测序技术

1请输入课题讲师：莫小贝2014-4-1第一讲第二讲第三讲........RNA-Seq技术背景RNA-Seq技术应用领域RNA-Seq技术原理RNA-Seq技术优势RNA-Seq技术面临的挑战及发展2014-4-1RNA-Seq技术背景RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptomesequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（WholeTranscriptomShotgunSequencingWTSS）2014-4-1RNA-Seq技术背景2014-4-1原则上，所有的高通量测序技术都能进行RNA测序，自2005年以来，Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生，之后HelicosBiosicences公司有推出单分子测序（Singlemoleculesequencing,SMS）技术。新一代测序技术又称作深度测序或高通量测序，是相对于传统的Sanger测序而言，主要特点是测序高通量，测序时间和成本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用侧重。罗氏公司鲁米那公司高通量测序法原理美国应用生物系统公司寡聚物连接检测测序赫利公司RNA-Seq技术背景2014-4-1广义：指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。转录组（transcriptome）狭义：指所有mRNA的集合。2014-4-1RNA-Seq技术背景转录组测序技术：是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。2014-4-1RNA-Seq技术背景高通量测序技术（High-throughputsequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万几百万条DNA分子进行序列测序，因此在有些文献中称其为下一代测序技术（nextgenerationsequencing）组件其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（deepsequencing）2014-4-1RNA-Seq技术背景有关于ncRNA的一些知识非编码RNA（ncRNA）主要包括：转运RNA（tRNA），核糖体RNA(rRNA)，小核RNA（snRNA），核仁小分子RNA（snoRNA），细胞质小分子RNA（scRNA），不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（microRNA,miRNA）等。功能：非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构、RNA加工修饰及稳定性、转录和翻译及一些蛋白质稳定性的影响。RNA-Seq技术原理2014-4-1把高通量测序技术应用到有mRNA逆转录生成的cDNA上，从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量，这就是mRNA片段或mRNA-Seq，同原理，各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量检测，统称作RNA-Seq。2014-4-1RNA-Seq实验流程图2014-4-1RNA-Seq实验步骤2014-4-1RNA-Seq测序数据的分析2014-4-1RNA-Seq提供试验报告原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。高级数据分析（应客户要求定制），如基因覆盖率和测序深度分析，基因表达差异分析，基因结构分析，鉴定选择性剪切现象，发现新基因，鉴定基因融合现象。2014-4-1RNA-Seq技术应用领域2014-4-1RNA-Seq技术优势*数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。*高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。*任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。*更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。2014-4-1RNA-Seq技术面临的挑战及发展RNA-Seq的发展前景虽然RNA-Seq的技术还面临着种种困难，但作为一个刚刚起步的新技术RNA-Seq出其他转录组学技术无可比拟的优势：既能提供单碱基分辨率的转录组注释又能提供全基因组范围的“数字化”的基因表达谱，而且其成本通常比芯片和大规模的SangerEST测序要低。2014-4-1RNA-Seq的发展前景就目前来看，作为两个高通量的转录组学研究技术，在应用的某些方面既存在重叠和竞争，也存在优势互补，一种技术能弥补另一种技术遗漏的部分，通常对一个生物学问题的回答需要不同实验技术的协同配合。2014-4-1RNA-Seq的强项就是在于它是一个“开发系统”，它的发现能力和寻找新信息的能力从本质上高于芯片技术，相信随着相关学科的进一步发展和测序成本的进一步降低，RNA-Seq必将在转录组学研究领域占主导地位。RNA-Seq的发展前景2014-4-1数字表达谱与芯片的比较2014-4-1庞大的数据量所带来的信息学难题如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所以基因中罕见RNA亚型的表达变化目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起始量，这使得来源极为有限生物样品分析受到限制，因此如何对单细胞或少量细胞进行转录测序是一个亟待解决的问题RNA-Seq面临的挑战2014-4-1RNA-Seq常见问题送样要求：浓度≥400ng/ul，RNA总量≥20ug；OD260/280为1.8-2.2，28S/18S1.8，RIN≥8在进行原核生物转录组分析时需要提供纯化后的原核生物mRNA或cDNA样品进行非编码RNA测序时需要提供去除rRNA和tRNA的RNA样品测序1Gb的转录组数据时通常可以得到长度大于500bp的Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成2014-4-1TheEnd