生物正交标记反应研究进展

综述Review*E-mail:[e-mail]29,2015;publishedMay10,2015.ProjectsupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.21225206,91313301).项目受国家自然科学基金委重大研究计划培育(Nos.21225206,91313301)资助.ActaChim.Sinica2015,73,783—792©2015ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences生物正交标记反应研究进展杨麦云陈鹏*(北京大学化学生物学系北大-清华生命科学联合中心北京100871)摘要对活体生物大分子进行特异性标记是一项具有挑战性的工作,它要求这类化学反应能够在生理条件下高效特异地进行,不会与生物体系中存在的各种活性物质发生副反应.昀近十几年开发的生物正交反应能够比较好地满足这些要求,它们在生物分子标记方面的应用拓展了我们对细胞内生物体系的理解.主要介绍那些应用广泛且可以用于活体细胞标记的生物正交反应.重点介绍通过位点特异性引入生物正交官能团来进行选择性标记细胞内目标蛋白质的策略.同时,我们根据使用催化剂类型对这些生物正交反应进行分类,并且列表比较它们的差异,以便于研究者挑选合适的反应.昀后对生物正交反应的开发和进一步应用进行了展望.关键词生物正交反应;活体细胞;蛋白质标记;位点特异性;非天然氨基酸ProgressintheBioorthogonalLabelingReactionsYang,MaiyunChen,PengR.*(DepartmentofChemicalBiology,PekingUniversity,Peking-TsinghuaCenterforLifesciences,Beijing100871)AbstractSelectivelabelingofbiomoleculesinsidelivingcellsisachallengingtask,whichrequiresthereactiontoproceedefficientlyandselectivelyunderphysiologicalconditionwithoutinterferingwithactivespeciespresentedinthelivingsys-tems.Bioorthogonalreactions,whichweredevelopedinthepastdecade,successfullymeettheserequirementsandtheirap-plicationsinbiomoleculelabelinghaveexpandedourunderstandingofcellularprocess.Considerableattentionhasbeenfo-cusedontheoptimizationofafewknownbioorthogonalreactions,includingdiscoveryofnewligandsandprivilegedsub-stratesfortransitionmetalcatalyzedreactions,andtheuseofstrainpromotedfunctionalgroupforsubstrateactivationinthecycloadditionreactions.Inaddition,newbioorthogonalreactions,includingthefluorogenicreactions,havealsobeenemergedinthepastfewyears.Progresshasalsobeenmadetowardthedevelopmentofmutuallyexclusivebioorthogonalreactionsandtheirapplicationformultiplelabelingofbiomoleculesinsidelivingcells.Herewereviewthemostwidelyusedbioorthogonallabelingreactions,drawingparticularattentiontothosethathavebeenusedinlivingsystems.Wefocusedontheselectivelabelingoftargetproteinsbymeansofsite-specificintroductionofafunctionalgroupfollowedbythebioorthogonalreactionwithacomplementaryfunctionalgroup.Wecategorizedthesereactionsintothreedifferentgroupsbasedonthecatalystsusedinthereactions:metalcatalyzedreactions,photoinducedreactionsandreactionswithoutcatalyst.Thebiologicalapplicationsofthesebioorthogonalreactionshavealsobeenbrieflyintroduced.Wealsolistedtheratecon-stantsandmainreferencesofthesereactionstofacilitateresearchersforchoosingtheappropriateone.Lastly,wehighlightongoingchallengesindevelopingnewbioorthogonalreactionsandtheirapplicationtostudycomplexbiologicalsystems.Keywordsbioorthogonalreaction;livingcells;proteinlabeling;site-specific;unnaturalaminoacid1引言对生物大分子(包括蛋白质、核酸、糖类等)的结构、功能和相互作用的研究是生命科学研究领域的一项重要任务,尤其是对这些生物大分子在活细胞内进行实时追踪,更有重要意义.蛋白质是细胞里昀主要的组成部分,开发用于蛋白质标记和实时追踪的技术可以增加我们对于生命系统的理解[1].一种广泛应用的方法是用荧光蛋白(fluorescentprotein)对目标蛋白进行标记,通过融合表达目标蛋白和荧光蛋白,可以检测荧光的方法来实时研究目标蛋白的功能以及定位等[2].荧光蛋白用于研究生物分子的优点在于:它可以融合表达在细胞体内,而不需要再对细胞进行其它处理;通过融合不同的信号肽段,荧光蛋白可以定位在不同的亚细胞结构,比如定位在细胞膜、细胞核或者线粒体等;另外,由于荧光蛋白可以有不同的突变体,不同的激发波长,从而可以实现对细胞中不同生物分子融合不同的荧光蛋白,从而实现不同目标蛋白的同时检测.然而,这种基于荧光蛋白的活体标记技术也有它的局限:荧光蛋白质本身就是一个大分子,其较大的空间位阻会影响目标蛋白质的结构进而影响功能;另外这种标记方式只适用于蛋白质的两端(即N端和C端)标记,无法做到特异性位点标记.针对这些问题,研究人员开发了通过化学反应对细胞内DOI:10.6023/A15030214化学学报综述784©2015ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciencesActaChim.Sinica2015,73,783—792蛋白质分子进行特异性标记的方法,这一类反应被称为生物正交反应.生物正交反应(Bioorthogonalreaction)是指一类可以在活体细胞中进行的化学反应[3].这类反应可以在生物体内的生理条件下发生,不会与体内同时发生的其他生化反应互相干扰,也不会对生物体和目标生物分子产生损伤.要完成对活体细胞内目标蛋白的标记,首先需要将可参与特异反应的功能基团引入目标蛋白,然后与带有互补反应基团的标记物进行生物正交反应,昀后利用不同标记物特征(荧光或免疫印迹)去检测目标蛋白的定位、结构或功能(图1).能够发生生物正交反应的这两个反应基团相互之间具有高度的反应活性,同时在生理环境下对周围其它的反应基团是惰性的.迄今为止,研究人员已经开发出了数种不同的生物正交反应,能够满足上述条件并且在生物体系中得到应用[4].本文对这些主要的基于位点特异性生物正交标记的反应进行文献综述:(1)将反应类型分为金属催化,光催化和无需催化剂3种类型;(2)对不同反应类型的反应速率进行了列表比较;(3)对这些生物正交反应的应用进行了简要的介绍.图1细胞内生物正交标记反应示意图.Figure1Schematicpresentationofbioorthogonallabelinginsidelivingcells2金属催化的生物正交反应2.1铜催化的生物正交反应(Coppercatalyzedbioorthogonalreaction)一价铜离子催化的叠氮和末端炔基之间的环加成反应(Coppercatalyzedazide-alkynecycloaddition,CuAAC)是使用昀为广泛的生物正交反应,也是“点击化学(clickchemistry)”[5]的代表.2002年,Sharpless课题组[6]和Meldal课题组[7]分别发现一价铜离子可以显著地加快叠氮和炔基之间的环加成反应,其反应速率要比没有金属离子催化的叠氮-炔基环加成反应快106倍以上[(65±10)L•mol－1•min－1vs(1.9±0.7)×10－5L•mol－1•min－1][8],迄今为止这一反应已经在生物体系中得到了广泛的应用,不仅用于生物分子的体外标记,而且也被用于生物分子的体内标记和追踪[9].关于这个反应的机理也引起了研究人员的关注和研究,基于密度泛函理论(densityfunctionaltheory,DFT)的计算,Sharpless等[10]提出了由一个铜离子参与循环的反应机理.但是相关的动力学实验表明,反应循环中可能存在由两个铜离子与炔基-叠氮共同形成的复合物[11].昀新研究表明,在这样的反应循环中确实存在由两个铜离子共同形成的复合物,由Fokin等[12]利用热流反应量热(heat-flowcalorim-etry)和同位素-质谱联用的方法,检测到反应中存在两个等价的铜离子,他们提出了由两个铜离子参与循环的反应机理.由于自由的一价铜离子可以参与很多氧化还原循环,产生对生物体系有毒的活性自由基,所以化学家们开发出了一系列配体来螯合铜离子(图2).这些配体不仅可以降低铜离子的毒性,而且可以稳定一价铜离子,加快反应速率,这类反应被称为配体辅助的CuAAC反应(ligandassistedCuAACreaction).Fokin等[13]在研究CuAAC合成多聚三氮唑时发现,这类反应的速率要比普通的CuAAC反应快很多,似乎具有自催化(autocatalytic)的效果.他们进一步的研究证实了这些寡聚三氮唑(比如TBTA)确实可以作为铜离子配体加快CuAAC反应.Tirrell课题组[14]利用TBTA作为配体,通过CuAAC反应对大肠杆菌外膜上已插入含有叠氮基团的非天然氨基酸(UAA,unnaturalaminoacid)的蛋白质标记了末端炔基修饰的生物素.由于TBTA水溶性较差,而且对细胞有毒性作用,Finn课题组开发出了水溶性较好的配体——THPTA,他们利用THPTA辅助的CuAAC反应对哺