生物质谱

生物质谱技术蛋白质组学前言1).质谱技术的特点质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器(Thompson)．但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比(m/zorm/e).质谱法是一强有力的分析技术。它可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方面；所需化合物的量非常低：10-12g,或10-15mole；应用范围广:(1)有机质谱法：生物、医药、聚合物、法医和环境等方面；(2)无机质谱法：地球化学，地质矿产和无机元素分析鉴定等方面。七年代初用于小分子分析鉴定的电离技术，如：电子轰击(Electronimpact,EI)电离和化学电离(Chemicalionization,CI)技术等。质量分析器主要为磁场分析器(magneticSector)。七十年代末、八十年代初出现了场解吸(Fielddesorption,FD)、场电离(Fieldionization,FI)和快原子轰击(Fast-atombombardment,FAB)技术。质量分析器主要为磁场分析器(sector)、四极杆滤波器(quadrupole,Q)和离子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器。近十几年出现了电喷雾电离(Electrosprayionization,ESI)技术、基质辅助激光解吸电离(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI)技术和表面增强激光解吸电离(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)技术等.质量分析器为磁场分析器(sector)、四极杆滤波器(quadrupole,Q)、离子阱分析器(Iontrap)、离子回旋共振(ioncyclotronresonance,ICR)分析器和飞行时间分析器(Time-of-flight,ToF)。2).质谱技术的发展灵敏度(sensitivity,S/Natng(orpg)/µL)分辨率(resolution,R=m/∆m,(1)半峰宽,(2)峰谷10%)质谱仪技术指标:∆mm10%100%m+1Full-widthathalf-maximum准确度(accuracy);ppm(partpermillion)稳定性(stability):仪器在一定时间间隔内某离子的m/z测量值的变化.质量范围(massrange):仪器可以检测离子m/z的范围.动态范围(dynamicrange):在动态范围内,样品量与仪器输出的信号应成正比例关系.A:离子的相对强度(Yaxis)B:离子的质量与电荷比(m/z,Xaxis)C:质谱图中最强的峰称为基峰(basepeak)D:相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度E:所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在的m/z位置而非真实的离子强度和离子.F:棒状谱(centroidalpeak)G:高斯峰(gausspeak)F质谱图意义G质谱与蛋白质•对于蛋白质的“鉴定”，较早期的方法是利用Edmansequencing，或是二维凝胶电泳技术。•但利用这些技术花費的时间较长；–如Edmansequencing，一天大概只能鉴定出一个或二个peptides•对于研究蛋白质组学的研究员来說，要用这些传统的方法来解出自然界中成千上万的蛋白质结构，实在是天方夜谭。•质谱(Massspectrometry)的发明，帶給了研究蛋白质的人无限的希望。•但从前质谱仅运用于小分子，对于像蛋白质这样大的分子是一筹莫展；因为在进行质谱分析时，必須將分子气化及帶上电荷。对于较小的分子而言，並不是相当困难，然而对于大的生物分子（如蛋白质分子），要將分子气化及帶电，同时不能伤害分子的完整性，非常不容易。•1960~1980，科学家发展出許多方式，尝試將生物巨分子从液相游离化成为气相分子，例如比较早期的化学游离法、或是电漿游离法。但是这些方法只能应用到10kDa以內的分子，对于动輒数百至数千kDa的蛋白质巨分子来說，还有相当远的一段路要走。•拜2002年的三位诺贝尔化学奖得主所赐，将质谱的技术做了最有效率的使用，且突破了小分子及固液相的限制，成功的运用这种技术于蛋白质的研究上。•他们是：–JohnB.Fenn;–KoichiTanaka;–KurtWüthrich•目前有两种做法能使得蛋白质转变为气态离子而不会改变其结构与形态。–由JohnB.Fenn所发展的方法是运用一个很強的电场將試样喷洒出去(ESI)，而产生一个个帶电荷並能自由飞翔的离子。–运用一个強烈的激光脉冲，在适当的条件下(視能量，与试样的結构和化学环境而定)运作，试样可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离子(MALDI)，由KoichiTanaka最先提出的技术。基本原理简介•质谱仪包含了五个主要的系统：–將不同型态样品倒入质谱仪的进样系统(sampleintroduction)–使样品游离成气态离子形式的离子源系统(ionizationsource)–依质荷比(m/z:masstochargeratio)不同分离各个样品离子的质量分析仪(massanalyzer)–探测各样品离子探测器(detector)–將离子探测訊號转換的数据处理系统(datasystem)。基本原理简介-概念•质谱(MS)是利用离子化的帶电物体在电场中的移动来探测出分子的重量。•所要测的蛋白质样本先做气相的处理且离子化，再利用荷质比(m/z)、也就是分子量对其所帶电荷的比值来做分离的动作，而其所帶的电荷有可能是正的也可能是負的。•大部分的质谱可被用在两个方面:•1.待测物的組成•2.待测物的結构•蛋白质(protein)是由氨基酸(aminoacid)所組成，而氨基酸是由碳、氢、氮、氧、硫等原子組成。而自然界中这些原子都含有同位素(isotope)，像是碳含有12C(98.9)及13C(1.1%)这两种同位素，利用质谱(MS)所测出来的結果，就会有这两种不同的光谱。•待测混合物所测得的結果有两种形式:–Averagemass:所有同位素的平均质量–Monoisotopicmass:第一个peak的同位素质量，这里的例子是指12C解析度(resolution)夠好的质谱就可以把12C和13C波峰和波谷分的很清楚，由图可知Averagemass和Monoisotopicmass的质差了0.37Da,这差异可用来做peptidemassfingerprinting。第一个高峰(peak)为12C同位素，接着为13C同位素，再接下去为二个13C同位素，以此类推…。12CMonoisotopicpeak並不会永远都是最高的，随着給予的混合物质量越来越大，13C也会越来越高。基本原理简介-电离Ionization•质谱进行分析时，首先要做的就是离子化(ionisation)，也就是將待测物处理过后产生气相的离子，並带有电荷。•两种最有效的测定蛋白质质谱的电离（软电离）方法：–MALDI–ESIWhyYouCan’tUseEI(Electronimpact)ForAnalyzingProteins•EI破坏化学键•任何给定的蛋白质包含20种不同的氨基酸•EI破坏蛋白质，生成氨基酸、氨基酸碎片、多肽（包含2,3,4…个氨基酸）等复杂的组合物•一个单一的蛋白质，其EI质谱会产生10,000种不同的峰--toocomplextoanalyzeSoftIonization•Softionizationtechniqueskeepthemoleculeofinterestfullyintact•Electro-sprayionizationfirstconceivedin1960’sbyMalcolmDolebutputintopracticein1980’sbyJohnFenn(Yale)•MALDIfirstintroducedin1985byFranzHillenkampandMichaelKaras(Frankfurt)•Madeitpossibletoanalyzelargemoleculesviainexpensivemassanalyzerssuchasquadrupole,iontrapandTOFSoftIonization337nmUVlaserMALDIcyano-hydroxycinnamicacidGoldtipneedleFluid(nosalt)ESI+_电喷雾电离质谱术ESI（electrosprayionisation）•电喷雾电离质谱术是一种分析生物分子的方法。由于可使用低的样品流速及与分离技术結合，其灵敏度大大增加，已成为分析蛋白质的重要工具。•利用高电压（約3000伏）將溶于水中的蛋白质經由喷嘴喷出許多帶正电（+2~+40）的小水珠，当水分慢慢蒸发之后，电荷数会慢慢增高，同时蛋白质的浓度也相应增高，此时荷质比高到可以被任何质谱分析仪所分析。•因一种分子可以被喷出不同核质比的气体分子，因此經由适当的运算（Fenn在1987年提出multiplechargetheory），精确的算出被分析分子的分子量。•相同的分子可能携帶不同的电荷，因此会得到一系列的訊號，虽然这个現象使得图谱变得复杂，但这也产生了更多的资讯，使得鉴定的工作变得较容易。Electrospray电喷雾电离流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子电喷雾电离质谱技术a).常规电喷雾源(mL/min)b).微升喷雾源(µL/min)c).毫微喷雾源(nL/min)DryinggasNebulizergasRayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets试样离子准分子离子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他离子ElectrosprayIonization•样品溶解在极性的、挥发性缓冲液中(不含盐)，通过不锈钢毛细管(70-150mm)以10-100mL/min的速度进样。•将3-4kV的高压加在喷嘴上，使样品变成雾状液滴。•雾状液滴直接穿过高真空区域，液滴逐渐挥发，尺寸慢慢接近样品分子的尺寸(依然携带一定的电荷)。ElectrosprayIonization95%H2O/5%CH3CN（乙晴）5%H2O/95%CH3CN100kV1000kV3000kVElectrosprayIonization•Canbemodifiedto“nanospray”systemwithflow1mL/min•Verysensitivetechnique,requireslessthanapicomoleofmaterial•Stronglyaffectedbysalts&detergents•Positiveionmodemeasures(M+H)+(溶剂中添加蚁酸)•Negativeionmodemeasures(M-H)-(溶剂中添加氨水)PositiveorNegativeIonMode?•如果样品具有容易接收H+的功能团(例如氨基化合物、肽和蛋白质上所带的氨基)，那么使用正离子检测法。•如果样品具有容易失去H+的功能团(例如羧酸、核酸和糖上所带的羟基)，那么使用负离子检测法。•溶液pH值的高低，控制了样品的官能基（functionalgroup）离子化的狀況。•pH值高于5，C-terminal的部份才会离子化，pH值低于7的時候，N-terminal及氨基酸hitidine的氮才会游离，lysine和arginine的N端通常要低于pH8.5才会离子化，这表示在酸性溶液中（如pH3.5或更低）会使蛋白质帶正電，在碱性环境中則让蛋白质帶負電，ESI一般都在酸性环境下分析帶正電的peptideion。Electrosp