第七章-生物质谱技术

第七章生物质谱技术2生物质谱概念与分类质谱的基本原理数据库检索与蛋白质鉴定3一、质谱原理1、发展历史1886：Goldstein发明早期质谱仪的离子源1912：质谱仪问世，对小分子化合物进行分析1942:第一台单聚焦质谱仪商品化50年代发展了气-质联用，进入混合物分析阶段4等离子体解吸（plasmadesorption,PD）、快原子轰击（fastatombombardment,FAB）：几千Da80年代末发明了两相软电离质谱技术ESI-MS和MALDI-TOF-MS.出现生物质谱，使质谱仪的应用又发生了一次飞跃，开始分析生物大分子给生命科学研究带来的影响是革命性的！562、质谱基本原理按离子质量数m与电荷数z的比值（称质荷比m/z）大小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或原子质量，它是一种物理方法，即物质粒子的质量谱。质谱原理：简单！能量守恒原理质谱仪器：不简单！能量守恒原理的具体实施者7质谱仪的基本组成1.离子源2.静电加速系统3.分离系统4.检测器和读出系统特点高真空度：机械泵（10-2），涡轮分子泵、油扩散泵（10-7-8）高电压：至2-3万伏接气相色谱、液相色谱：分析混合物质量分析器质量检测器离子源加速电场8样品导入系统：固体坩埚、样品靶、毛细管、探针等离子源：电子轰击、场电离、场解析、化学电离、激光电离、电喷雾等加速系统：高静电场分离系统：电磁铁、四极杆、飞行管、离子阱以及混合分离器检测系统：电子倍增器、光电倍增管、微通道板（MCP）等数据处理系统：模数转换系统、示波器、计算机9样品导入：直接进样固体靶HPLC导入GC导入离子原：EI、CI、FAB（快原子轰击）、FD（等离子体解吸）、FI、MALDI、ESI质量分离器：电磁铁（M）四极杆（Q）飞行管（TOF）离子阱（TRAP）检测器：电子倍增器光电倍增管微通道板任意组装质谱仪10二次离子质谱：由一定能量的一次离子（离子枪）打在样品靶上溅射产生出二次离子的质谱。如：FAB、MALDI等。适合于分析不易挥发、热不稳定的有机大分子。离子源样品质量分析器检测器一次离子二次离子11分析物质类型小分子物质：磁质谱、四极质谱、离子阱提供碎片信息：磁质谱（电子轰击源）、三级四极质谱、飞行时间质谱（PSD）、电喷雾串联质谱（Q-TOF）等大分子物质：生物质谱：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、液相色谱-电喷雾-串联质谱（CapLC-ESI-Q-TOF-MS）、液相色谱-离子阱质谱（MDLC-IonTrap）12质谱仪基本指标分辨率：M/△M，5000，给出元素组成灵敏度：S/N，50:1，fmol准确度：error，10-3Da,50ppm131415生物质谱的两种软电离技术基质辅助激光解吸电离(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI)电喷雾电离(Electro-SprayIonization,ESI)16生物质谱技术的应用一、分子量测定（蛋白酶切）+一级质谱二、蛋白质的氨基酸序列测定蛋白酶切+二级（串联）质谱17KarasandHillenkamp,1998年提出：AnalChem.,1998,60(20):2299-2301.基本原理：将分析物分散在基质(Matrix)分子中并形成共结晶,当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时,基质分子吸收激光能量与样品解吸附，基质－样品之间发生电荷转移使样品分子电离。二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MatrixAssistedLaserDesorptionIonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS1、MALDI离子源18基质的作用：吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相,样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。19基质简称中文名称英文名称波长SA芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)Sinapinicacid(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)337nm355nmDHB龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)Gentisicacid(2,5-dihydroxybenzoicacid)CCAα-氰基-4-羟基肉桂酸α-cyano-4-hydroxycinnamicacidPA吡啶甲酸Picolinicacid3HPA3-羟基吡啶甲酸3-hydroxypicolinicacid常用基质（一些小分子有机酸及其衍生物，能很好吸收激光能量）20-Cyano-4-hydroxycinnamicacidForPeptidesSinapinicacidForFulllengthProteins2,5-DihydroxybenzoicacidForPeptides显微镜下不同基质在靶体上形成的晶体21MALDI源激光是脉冲式，每一脉冲激光产生的一批离子得到一张质谱图，一般的质谱图是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。MALDI源离子为单电荷离子，谱锋与样品组分质量数有一一对应关系，适合于多肽与蛋白质混合物分析，灵敏度高（fmol,10-15-amol,10-18）。22高灵敏度，分析浓度至低fmol或高amolTOF分析器可分析大分子量的物质软电离方式，主要产生单电荷离子，谱图易解析容忍盐浓度：phosphatebuffers20mMTrisbuffer50mMDetergents0.1%SDS0.01%反射式TOF具有高分辨率MALDI的优点232、线性飞行时间质量检测器(liner-TOF)由E=U·z=1/2mv2和t=L/V推出t=const·m/v（飞行时间与质荷比的平方根成正比）E：离子在加速电场获得的动能;U：加速电场电压z：离子所带电荷;m：离子质量v：离子飞行速度;L：飞行管道长度t：离子飞行时间;const：常数质量分析范围：500Da---100KDa243、反射飞行时间质量检测器(reflectronRE-TOF)飞行管道内加了反射电场，(ionmirrororreflectron)，改进仪器的分辨率和质量测量准确度能量聚焦作用:具有相同质荷比但能量有细微差异的离子在反射电场作用下飞行时间达到一致，同时离子改变了飞行方向，延长了飞行距离源后衰变(post-sourcedecay,PSD)分析质量分析范围：800Da---10KDaDetector252627PSD:post-sourcedecay源后衰变分析一种串联质谱，获得离子的结构信息。MALDI源产生的母离子在飞行过程中发生裂解，丢失部分中性碎片，剩余的子离子成为亚稳离子（质量减少，飞行速度不变），飞行时间与离子质量成正比，与反射电场的电压成反比。284、样品制备基质：CCA：α-氰基-4-羟基肉桂酸，用0.1%TCA,30-50%ACN配成饱和溶液，稀释1-3倍，每天新鲜配制。样品：溶于0.1%TCA。基质与样品1：1体积混合，取0.5-1ul加到样品靶上挥发干后送如仪器。29TargetLaserFlightTubeDetectorComputerSampleIonizationSeparationDetectionMALDI-TOF-MS仪器结构图30基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。三、液相色谱－电喷雾－串联质谱(LC-ESI-MS/MS)1、电喷雾电离源FennJ.B.etal,Science,1989,246(4926):64-7131电喷雾电离源原理322、四极杆质量分析器串联质谱：由离子源、多级质量分析器、碰撞室组成。第一级起质量过滤作用，挑选出母离子（precursororparention）进入碰撞室，经碰撞诱导离解（collisioninduceddesorption,CID），产生碎片离子/子离子（productordaughterion）,由第二级分析子离子的质荷比。通过母离子和子离子的质量分析，可获得母离子的结构信息。33多级质量分析器有：三级四级杆质量分析器离子阱质量分析器四级杆TOF质量分析器34Scanningofmeasuringrange:U(DCvoltage)V(peakamplitudeofaradiofrequency)UandVarevariedU+Vcos2ftUVcos2ftacanddcvoltagesionswithcorrespondingm/zionscollidewiththerodsDetector四级杆质量分析器35QuadrupoleGold-coatedglasscapillarydetector(multiplier)sprayopening:1-2mm++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++vacuumOrificesolventsN2accVChargeddropletsTaylorconesIons电喷雾-四极杆质谱(ESI-QuadrupoleMS)36Q-TOF分离器特点+灵敏度流通量分辨率样品需要量：0.5-1ul20-200fmol/ul37ESI-MS谱图（ESI-Q-TOFMS谱图）电喷雾电离产生多电荷峰，质谱图显示离子带不同电荷数的一系列质荷比峰[M+nH]n+，根据这些峰值换算出离子电荷和分子质量。检测范围大于质量扫描范围[M+12H]12+=714.7714.7×12－12＝8564.4[M+13H]13+=659.8659.8×13－13＝8564.438串联质谱(MS/MS)由离子源、多级质量分析器、碰撞室组成。第一级质量分析器起质量过滤器的作用，从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子(precursororparention)进入碰撞室，母离子在碰撞室内经高流速惰性气体碰撞诱导离解(collisioninduceddesorption，CID)产生碎片离子/子离子(productordaughterion)，第二级质量分析器分析子离子的质荷比。研究母离子的裂解规律，获得母离子的结构信息。39rfHexapolerfHexapolesReflectronPusherDetectorQuadropoleinwidebandpassmodeSkimmerElectrosprayTOFOrifice四极杆-飞行时间质量分析器(Quadrupole-TimeofFlightanalyzer,Q-TOF)四极杆分析器用于离子选择，其后有一个六极杆射频场用于离子的碰撞诱导解离产生子离子，母离子和子离子的检测均由最后的飞行时间检测器完成40abc母离子子离子谱—多肽氨基酸序列总离子流色谱图HPLCMS1MS2与LC连接，分析混合物极高的灵敏度软电离方式基本不产生碎片离子孔电压调节可以控制碎片离子的产生使样品带多电荷，可以分析大分子量的物质ESI的特点42生物质谱与其他质谱的比较43价钱便宜MS/MSn多级碎片谱图与一般质谱不同，需要特殊分析离子阱质谱44TheIonTrapMassSpectrometerOctapoleCapillarySkimmerElectrosprayIontrapDetectorOrifice45TheIonTrapPrincipleringelectrodeinletcapionsinionsoutoutletcapHeioncloudbipolarhighfrequencyquadrupolarhighfrequency+++++由三个双曲面电极（一个环型，2个