SDS-PAGE解析

报告人：刘陈飞SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一.简介丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂（如过硫酸铵）作用下形成的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶：SDS：一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。二.操作步骤制板制分离胶制浓缩胶电泳槽安装加样电泳剥胶染色脱色结果观察1.制板2.配胶分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)ddH2O4.05ml6.8ml30%Acr3.3ml1.7mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.25ml10%SDS100µl100µl10%Ap50µl100µlTEMED10µl10µl3.制样及点样将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。将蛋白质样品与5X上样缓冲液混合后，在100℃水浴中加热5-10分钟使蛋白质变性。10,000rpm离心1分钟，取上清加样。点样时，枪头垂直对准孔的中间，缓慢加样，移开枪头时防止倒吸。加样时不得插伤凝胶孔胶面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。4.电泳和剥胶调节电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm。用刀片将两块玻璃板撬开，将带有凝胶的玻璃板放到水龙头下，用水流将胶缓慢冲到培养皿中。5.染色和脱色一般方法：染色1-2小时，脱色1~2天，至背景为色位置。快捷方法：染色，100℃煮15分钟。脱色，100℃煮15分钟，更换脱色液，重复数次直至条带清晰可见。考马斯亮蓝染色：结合在蛋白质的碱性基团上。银染色：银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳根据带电颗粒在电场中泳动的电荷效应，分子筛效应（聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应）和浓缩效应来达到分离蛋白质和寡居核苷酸的目的。[1]◇电荷效应：蛋白质带负电荷，在电场中从阴极到阳极泳动。阴极阳极◇分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。因为:SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。[2]◇浓缩效应：浓缩胶（堆积作用）分离胶（分离作用）凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选pH6.8的TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。和蛋白质一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。最后经过分离胶分离开来。三.电泳过程中的不正常现象（1）“微笑”现象指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀凝聚，中间部分凝聚不好。（2）“皱眉”现象由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。三.电泳过程中的不正常现象三.电泳过程中的不正常现象（3）“拖尾”现象样品溶解不佳引起。三.电泳过程中的不正常现象（4）“纹理”现象由于样品中的不溶颗粒引起的。三.电泳过程中的不正常现象（5）偏斜现象电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起三.电泳过程中的不正常现象（6）带太宽，连在一起加样量太多或加样孔泄漏引起四结果处理测量相对泳动率Rm值，计算分子量•测量溴酚蓝的泳动距离，将它作为相对泳动率的标准1.0。测量标准分子量蛋白质的泳动距离，算出它们的Rm值（Rm=样品迁移距离／染料迁移距离）。•以分子量的对数值为横坐标，Rm值为纵坐标，将标准分子量蛋白质的坐标点连为一条直线，即得标准曲线。•算出样品蛋白质的Rm值，从标准曲线上查出其分子量的对数值，换算出分子量。•图1SDS-PAGE测定蛋白质分子量的电泳图谱CDE•图1中，标准蛋白产生的6条条带分别标记为a、b、c、d、e、f，卵清蛋白产生的两条条带分别标记为A、B；人血清蛋白产生的三条带分别标记为C、D、E。5、10分别指样品蛋白质加样量；•在图中测量出下列值：溴酚蓝的泳动距离D=9.7;•标准蛋白的泳动距离：Da=1.0；Db=1.5；Dc=2.6；Dd=3.7；De=5.1；Df=6.2。•标准蛋白的相对泳动率：Ra=0.103；Rb=0.155；Rc=0.268；Rd=0.381；Re=0.526；Rf=0.639。•卵清蛋白的泳动距离：DA=1.7；DB=3.4；人血清蛋白的泳动距离：DC=1.9；DD=4.2；DE=4.9。•样品蛋白质的相对泳动率：RA=0.175；RB=0.351；RC=0.196；RD=0.433；RE=0.505。(Rm=Dm/D)•表1标准蛋白的lgMW与Rm值•abcdef•Rm0.6390.5260.3810.2680.1550.103•lgMW4.154.304.494.634.824.99•各条带对应的标准蛋白分子量的对数值与相对迁移率见表1。根据表1，以标准分子量的对数值（lgMW）为横坐标，相对迁移率（Rm）为纵坐标，将标准蛋白质的坐标点连为一条直线，即得标准曲线（图2），并根据此曲线得趋势线公式：y=-0.1116x+0.7359，由该公式计算出样品蛋白质中各个条带相对应的蛋白质样品分子量对数值，换算出分子量。图２　用低分子量标准蛋白所做的标准曲线y=-0.1116x+0.735900.10.20.30.40.50.60.7012345671.丙烯酰胺、双丙烯酰胺和TEMED具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配，4℃冰箱贮存不超过7天。五.注意事项六.SDS-PAGE优点1.一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明5.网孔可调节七.SDS-PAGE缺点1.凝胶聚合易受各种因素影响2.丙烯酰胺有毒性，能致癌致突变3.TEMED，易燃易挥发，有强神经毒性4.不适用分子量相同或相近的蛋白八.SDS-PAGE的应用1.蛋白质纯度分析；2.蛋白质分子量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量；3.分离和浓缩用于产生抗体的抗原；4.免疫印迹westernblottingThankYou谢谢观看