小鼠基因型鉴定说明书Mouse-Genotyping

PD101-01OneStepMouseGenotypingKitVazymebiotechco.,ltd.本试剂盒包含整套的DNA粗提取以及PCR扩增体系，可用于小鼠基因型快速鉴定(RapidGenotyping)。该试剂盒可用于从小鼠尾巴、耳朵以及脚趾等组织快速提取基因组DNA，提取产物可直接进行PCR扩增，无需匀浆、破碎、过夜消化、酚氯仿抽提、DNA沉淀或柱式纯化等操作，极大缩短了实验耗时。使用时，将组织浸泡在预添加了ProteinaseK的裂解液中，55oC孵育20min再95oC加热5min灭活ProteinaseK。裂解产物经离心后可直接用做PCR扩增模板，经反复测试广泛适用于2kb以内目标片段扩增，并适用于4对引物以内的多重PCR反应。试剂盒中配有2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)(P212)，包含高性能的TaqPlusDNAPolymerase，dNTP以及优化的缓冲体系。PCR反应时只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了开管/移液等操作，显著降低了样品交叉污染并且提高了检测通量和结果的重现性。独特的保护剂使得TaqPlusMasterMix经过反复冻融后仍可保持稳定的活性。体系中预混有电泳缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便快捷。PCR产物的3’端带A，可克隆至T载体，并适用于ClonExpressTM快速克隆试剂盒(C112/C113)。50μlPCR反应体系中，以2μl小鼠尾巴裂解产物为模板，扩增小鼠基因组p53gene。35个循环后将1/10PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的2kb条带。1×MousetissueLysisBuffer4oC保存；其余组分-20oC保存。保质期为半年。产品简介小鼠基因分型小鼠转基因检测小鼠基因敲除分析应用范围产品组成储存条件质量控制1×裂解液(单样品）Proteinase4μl1×MousetissueLysisBuffer200μl应用实例1.DNA提取推荐组织使用量-3～5mm小鼠尾尖-5～10mm2小鼠耳朵-1～2个小鼠脚趾操作注意事项：用70%的乙醇(自备)预先清洗组织分离过程中所使用的所有工具；ProteinaseK灭活步骤(95oC，5min)必须进行，其残留活性会抑制后续PCR反应；PCR反应体系配制过程应于冰水浴中进行，以提高扩增特异性(热启动)。1.1.根据需要裂解样品数量配制适量1×裂解液，单个样品所需裂解液配制方法如下：注意：应使用新鲜配制的1×裂解液；各组分添加完成后请涡旋震荡，充分混匀后再使用。组分PD101-01200rxn1×MousetissueLysisBufferProteinaseK2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)MgCl2(25mM)5×PCREnhancer40ml800μl5ml500μl2ml南京诺唯赞生物科技有限公司江苏省南京市玄武区双拜巷78号电话86-25-84365701传真86-25-84365976网址扩增片段长度55oC推荐孵育时间*1TaqPlusMasterMix(DyePlus)中预混有1.5mM的Mg2+。在实际使用过程中，可使用试剂盒提供的25mMMgCl2进行调整，调整间隔为每次增加0.5mM。*2裂解产物加入量不应超过PCR反应总体积的1/10。*35×PCREnhancer可显著提高GC-rich片段的扩增效率。在初次使用某引物对进行扩增时，可设置添加/不添加两平行对照组。如添加后扩增产量或特异性无明显提升，则无需添加。500bp1000bp1500bp10min20min30min94oC94oC55oC*72oC72oC5min(预变性)30sec30sec30sec/kb7min(彻底延伸)35循环}*退火温度需要根据引物Tm值进行调整，一般设置成低于引物Tm值1-2℃即可。A.扩增产量低或者无法扩增1.组织中的一些PCR抑制物混入裂解液中：可尝试将裂解产物稀释10倍后再进行PCR扩增；2.DNA提取效率较差：可尝试延长55oC孵育时间至3小时；3.ProteinaseK没有充分灭活：灭活步骤在沸水浴中进行；4.PCR循环数不够：一般而言，30～35个循环已经足以扩增足量的产物。然而对于某些片段，提高循环数可以获得更好的扩增效果；5.扩增反应退火温度设置太高：降低退火温度(每次降低3oC)；6.PCR引物错误：设置以纯化过的小鼠基因组为模板的阳性对照反应。B.非特异性产物很多1.PCR反应体系在室温下配制：在冰水浴中配制反应体系可显著降低非特异性扩增；2.扩增反应退火温度设置太低：提高退火温度(每次提高2oC)；3.PCR引物错配严重：重新设计引物。C.阴性对照也出现扩增PCR反应体系出现污染：逐个更换DNA提取体系、PCR扩增体系中的每一个组分。常见问题与解决方案2.PCR扩增2.1.2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)解冻完全后，上下颠倒混匀。于冰水浴中配制如下反应体系：2.2.推荐PCR反应条件设置：2.3.扩增产物直接进行琼脂糖电泳检测，无需添加DNALoadingBuffer。1.3.孵育完成后，将样品置于95oC或者沸水浴中加热5min灭活ProteinaseK。1.4.将裂解产物涡旋震荡充分混匀后，12000rpm离心5min，上清即可用于PCR反应。如将上清转移至另一个灭菌EP管中，-20oC可存放至少三个月。1.2.在灭菌1.5mlEP管中，添加200μl1×裂解液至所需裂解组织中，涡旋震荡后在55oC水浴中孵育20min。为保证DNA释放效率，请务必将组织全部浸没至裂解液中。孵育结束后组织块可能并未消化完全，属正常情况，不影响使用。对于常规大小目标片段，20min孵育已足以释放足量的DNA模板。孵育时间也可根据实际情况进行调整，下表为55oC下推荐孵育时间：ddH2O2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)*1裂解产物*2引物1(10μM)引物2(10μM)5×PCREnhancer(Optional)*3to50μl25μl25μl2μl2μl10μl南京诺唯赞生物科技有限公司江苏省南京市玄武区双拜巷78号电话86-25-84365701传真86-25-84365976网址