蛋白质的测定

DeterminationofproteinandaminoacidinFood第九章蛋白质及氨基酸的测定第一节概述1.蛋白质的元素组成（Theelementsofprotein）C：50-55%N：15-18%O：20-23%H：6-8%S：0-4%微量元素：P、Fe、Zn、Cu2、基本结构单位：氨基酸3、蛋白质的变性作用。4、蛋白质分析的重要性生物活性测定功能性质调查营养标签总蛋白质含量氨基酸组成蛋白质的营养价值5、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法杜马斯法福林酚法染色法第二节蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了5种染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）第三节蛋白质的定量测定关于氮-蛋白质换算等数6.25=6.25=6.38=5.95一、凯氏定氮法常量凯氏定氮法1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定①消化(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O1加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点2加硫酸铜作为催化剂、消化终点指示剂3加氧化剂加速有机物氧化速度②蒸馏NH4++OH-==NH3+H2O影响氨化完全和速度的因素（1）K氏烧瓶和取样量（2）分解剂1g样品K2SO4：H2SO4=7g:12ml还有一种比例：K2SO4：H2SO4=10g:20ml1用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿）指示剂红色绿色红色（酸）（碱）（酸）③吸收与滴定反应式为：NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-H2BO3-+H+==H3BO32用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液。现测定某一种食品的蛋白质的含量，这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h后，估计消化完全，取出消化液加入少量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。大量的脂肪振摇大火加热消化2h后，估计消化完全量NaOH少计算X=1000W%100K)(CMVVN21X为样品中蛋白质的含量V1为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度MN为氮的摩尔质量W为样品的质量K为氮换算为蛋白质的系数1.装水至2/3容积处，加甲基橙数滴及硫酸数毫升以保持酸性7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时，蒸馏10min，将管尖端提离液面再蒸馏1min，用水冲洗管尖后停止蒸馏同时做空白8.吸收液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至微红色为终点2.管下端插入液面下(瓶内先装硼酸液及混合指示剂2滴)3.消化液10mL4.NaOH溶液5.水洗漏斗数次6.夹好漏斗夹，水封。4.5.6步操作要迅速微量凯氏定氮法凯氏定氮仪凯氏定氮仪二、双缩脲法NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2△150~160℃双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物。紫色络合物。操作方法1、制作标准曲线取10支干试管分成两组，按下表平行操作：012345标准蛋白液/ml0.20.40.60.81.0蛋白浓度/(mg/ml)2.04.06.08.010.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂/ml4.04.04.04.04.04.0A540取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2、样品测定取4支试管分成两组，按下表平行操作：01样品稀释液/ml0.5蒸馏水/ml1.00.5双缩脲试剂/ml4.04.0A540取两组测定的平均值计算：Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml）N为稀释倍数c为样品原浓度（mg/ml）。%100(%)cNY固体样品蛋白质的含量3、计算福林-酚法（双缩脲法的发展）两步反应(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质—铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。杜马斯法（燃烧法）样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。几种蛋白质测定方法比较凯式定氮法双缩脲杜马斯福林-酚原理装置溶剂时间灵敏度干扰总氮量蛋白氮总氮量蛋白氮凯式定氮装置分光光度计高温装置、GC分光光度计浓硫酸用量较少不需要福林-酚试剂长简单快速3min简单快速较低低高高较小有干扰较小酸类及柠檬酸类其他方法染色法紫外吸收法水杨酸比色法采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：水份含量=8.0%，1号样品重量=1.015g，2号样品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度=0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数=22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL，空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。第四节氨基酸定量测定一、甲醛滴定法氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。反应式（有几种不同的推论）如下：双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂同时取两份样①+中性红，用NaOH滴定②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定二、非水溶液滴定法在水溶液中1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。溶剂选择原则1、不引起副反应2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物3、应考虑溶剂的酸碱性对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好氨基酸的非水溶液滴定1、选择冰乙酸作为溶剂2、选择高氯酸进行滴定三、电位滴定法根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定的终点。pH8.29.2氨基酸自动分析仪法在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL,加入10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2时，消耗标准碱液10.12mL,同法作空白实验，滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液0.08mL,加入甲醛后滴定至pH9.2时，消耗标准碱液0.90ml。问该样品的氨基酸态氮含量？0.301%你算对了吗？