蛋白质芯片综述

蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-1-蛋白质芯片技术研究综述XXX山东大学生命科学学院，250100摘要：蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，是近年发展起来的一项生物检测技术，这项技术是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上，利用荧光或酶显色进行探测，最后用特定的计算机软件加以分析。本文简要综述了该技术在对基因表达、抗原抗体检测、蛋白质筛选、药物开发、疾病诊断以及酶的检测等研究方面显示出的能力。并指出了该技术的优点和存在的问题以及未来的发展前景。关键字：蛋白质芯片、蛋白质组学、检测技术1.前言随着人类基因组计划的完成和推进，生命科学研究已进入后基因组时代——功能基因组时代，其核心便是蛋白质组研究。蛋白质作为生命活动中多项功能的执行体，能直接反映基因给予的信息，其表达谱比基因表达谱更能直接反映生物体的功能机制，目前已经成为新的研究热点。1994年澳大利亚学者Wilkins和Williams等人提出蛋白质组(Proteome)[1,2]的概念是指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一种细胞、组织或完整生物体在特定时空上所拥有的全套蛋白质．随着蛋白质组学概念的提出及其研究的进行，人们需要一种新的技术来进行大规模的蛋白质分析，蛋白质芯片技术随之应运而生。蛋白质芯片(proteinchip)技术是生命科学与微电子学等学科相交叉的一门高新技术。利用这项技术可同时对多种蛋白质进行检测分析，使用常规方法需上千次才能完成的分析在蛋白质芯片上仅需一次就可以完成，并且检测到的平行数据误差更小，更准确，这对于高通量基因表达的研究具有非常重要的意义。蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-2-2.蛋白质芯片的分类1)蛋白质芯片根据功能可分为功能研究型芯片和检测型芯片。功能研究型芯片多为高密度芯片，载体上固定的是天然蛋白质或融合蛋白。该种芯片主要用于蛋白质活性以及蛋白质组学的相关研究；检测型芯片的密度相对较低，固定的是抗原、抗体等，主要用于生物分子的大量、快速检测。2)根据芯片表面的不同化学成分，蛋白质芯片可分为化学表面芯片和生物表面芯片。化学表面芯片分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属螯合芯片，用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱；生物表面芯片分为抗体。抗原、受体一配体、DNA一蛋白质芯片等种类。3)按点样蛋白质有无活性功能，蛋白质芯片分为无活性和有活性芯片。无活性的芯片是将已经合成好的蛋白质点在芯片上，其制作方式主要分为原位合成、点合成、光蚀刻术等3类；有活性的芯片是指点在芯片上的样品是活的生物体(如细菌)，在芯片上原位表达蛋白质。相对于无活性的芯片，有活性的芯片可以提供模拟的机体内环境，对于蛋白质功能分析更为有利。4)按载体的不同可分为普通玻璃载体芯片、多孔凝胶覆盖芯片、微孔芯片等[3]。3.蛋白质芯片的制备及分析过程3．1载体的选择用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶状态行使功能的固相材料统称为载体。制作蛋白芯片的载体材料必须符合下列要求：1)载体表面有可以进行化学反应的活性基团，以便于蛋白分子进行偶联；2)探针固定后能够保持蛋白质的活性；3)使单位载体上结合的蛋白分子达到最佳容量；4)载体具有良好的生物兼容性；5)载体应当是惰性的，并且有足够的稳定性，包括物理、化学和机械的稳定性；6)不同批次基片之间以及同一基片各点之间均一性好。目前已用于制作蛋白质芯片的载体主要有各种化学膜、聚丙烯酰胺凝胶、多孔硅胶、玻璃片、云母、硅片、金片等。玻璃片具有表面光滑、成本低、性能稳定等优点，已经被广泛应用于蛋白质芯片的制作。蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-3-3.2抗体或抗原的固化抗体或抗原的固化方法主要有2种：化学性、生物性。化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等；生物性配基包括受体、配体、酶、抗体、抗原等。它们的相应检测对象分别是：配体、受体、底物、抗原抗体结合蛋白。待固定的生化分子(配基)可通过化学键直接固定，也可不直接通过化学键固定于载体上，而是先将能与之特异结合又不干扰其活性的分子偶联载体上，再通过专一性、高亲和力作用间接固定配基[4]。3．3探针蛋白的制备抗体是最广泛使用的探针蛋白，传统的杂交瘤细胞技术用于单克隆抗体的研制所需时间长，产量低，已经不能满足芯片生产的需要，因此，目前已经着力发展的噬菌体抗体库技术和重组抗体库技术将在探针蛋白的生产中发挥重要作用[5]。利用96微孔板和高亲和力标签融合蛋白的自动化蛋白质生产也能提供更多的探针蛋白[6]。3．4蛋白质的预处理蛋白质芯片制作过程中保持蛋白质的生物活性，是蛋白质芯片发展的瓶颈技术。通常点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解，一般是采用含40％甘油的磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶解蛋白质，这样即可以防止水分的蒸发，又可防止蛋白质变性，以保持其固有的生物活性。3．5芯片的点印芯片的点印方法一是用手工点样制备低密度蛋白质阵列[7]；二是用阵列针头点样制备蛋白质芯片，这种方法在操作中将蛋白质吸附在针头上，通过针头与固相介质的接触将蛋白质点到介质表面形成阵列[8]；三是用喷墨打印头将蛋白质样品喷点到固相介质上形成阵列[9]。其中后两者是用机器精确控制的，能够高效率制备较高密度的蛋白质芯片，是今后制作高密度蛋白质芯片的主要方法。3．6蛋白质的固定以玻片为载体的芯片固定时放人湿盒中，37℃恒温1h即可；醛基修饰的玻璃芯片固定是通过醛基和蛋白质中的氨基共价结合来固定的。3．7芯片的封阻封闭液通常使用含1％小牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液，其目的是封闭芯片上未结蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-4-合配基的基团，以减少其他蛋白的非特异结合。3．8蛋白质芯片的检测3．8．1间接检测法样品中的被检测物质要预先用标记物进行标记，与蛋白质芯片发生特异性的结合后，使用特定的检测或扫描装置将信号收集，再经计算机分析处理。目前，标记物主要包括荧光物质、化学发光物质、酶及同位素等。应用最广的是荧光染料标记，其过程是用荧光染料Cy3或Cy5直接标记待检测的蛋白质，或标记该蛋白质的二抗和芯片上的蛋白质结合后，用激光扫描和CCD照相技术对激发的荧光信号检测，再用计算机和相应的软件系统进行分析。其突出优点就是简捷、直观，不足之处在于易产生蛋白质间的非特异性作用，且标记物的加入可能会降低分析的准确度。3．8．2直接检测法因为标记分子有可能会影响蛋白质活性，作为直接检测法的无标记模式，如SELDI技术、表面等离子共振技术(SPR)、光学蛋白质芯片技术、原子力显微镜等在蛋白质天然活性检测方面有着特别的优势。4.蛋白质芯片的应用蛋白质芯片技术的研究对象是蛋白质，而在机体内执行着大量生物功能的正是蛋白质，所以蛋白质芯片有其独特的优点和应用前景。4.1用于基因表达的筛选AngelikaL[10]等人从人胎儿脑的cDNA文库中选出92个克隆的粗提物制成蛋白质芯片，用特异性的抗体对其进行检测，结果的准确率在87％以上，而用传统的原位滤膜技术准确率只达到63％。与原位滤膜相比，用蛋白质芯片技术在同样面积上可容纳更多的克隆，灵敏度可达到pg级，这大大减少了实验的次数，提高了实验的灵敏度。4．2用于特异性抗原抗体的检测在CavinM．[11]等人的实验中，蛋白质芯片上的抗原抗体反应体现出很好的特异性，在一块蛋白质芯片上10800个点中，根据抗原抗体的特异性结合检测到唯一的1个阳性位点。CavinM，指出，这种特异性的抗原抗体反应一旦确立。就可蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-5-以利用这项技术来度量整个细胞或组织中的蛋白质的丰富程度和修饰程度。其次利用蛋白质芯片技术，根据与某一蛋白质的多种组分亲和的特征，可以筛选某抗原的未知抗体，从而将常规的免疫分析微缩到芯片上进行，使免疫检测更加方便快捷。4.3用于蛋白质的筛选及功能研究常规筛选蛋白质主要是在基因水平上进行，基因水平的筛选虽已被运用到任意的DNA文库，但这种文库多以噬菌体为载体，通过噬菌斑转印技术(plaqueliftprocedure)在一张膜上表达蛋白质。这种方法是有效的，但由于许多蛋白质不是全长基因编码，而且真核基因在细菌中往往不能产生正确折叠的蛋白质，况且噬菌斑转移不能缩小到毫米范围进行，所以这种方法往往具有很大的局限性，而蛋白质芯片恰好弥补了这些不足。酶作为一种特殊的蛋白质，可以用蛋白质芯片来研究酶的底物、激活剂、抑制剂等[12]。Zhu等已用蛋白质芯片对酵母蛋白酶的生物活性进行了分析。另外还可以根据同源蛋白质上的特异残基，用蛋白质芯片区分同源蛋白质[13]。4．4用于新药的研制开发在许多新药的开发过程中，往往到了临床检验阶段才发现其具有很大的副作用而无法成为新药，这对前期的研究工作造成很大浪费。利用蛋白质芯片在药物研制初期就可检验该药物是否只与某一蛋白质结合而不与其它蛋白质结合，从而确定该药是否有副作用。这便于及早发现问题，有利于开发无副作用的新药。4．5用于疾病研究用蛋白质芯片可以绘制正常人和疾病患者体内的蛋白质图谱，通过对两者的比较找到在疾病中特异表达的蛋白质，然后将这些疾病中特异表达的蛋白质制成芯片，为肿瘤和其它传染性疾病等的诊断提供一种方法。肿瘤诊断的一般管理及程序如下：首先从正常及肿瘤组织中分离提取蛋白质，从抗体库中挑选有潜在诊断意义上的抗体，点布在片基上制备抗体芯片，高滴度的抗体库是这一研究的关键，来源于正常及肿瘤组织的蛋白质分别与抗体芯片反应，实验结果通过计算机进行分析[14]。Englert将抗体点布在片基上，用它检测正常组织和肿瘤之间蛋白质表达的差异，发现有些蛋白质的表达，如前列腺组织特异抗原、明胶酶A蛋白在肿瘤的蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-6-发生发展中起着重要作用，这为肿瘤的诊断和治疗带来了新途径。该方法的另一优点，可以对样品进行高通量筛选，对于肿瘤的普查有利。蛋白质芯片还可以给不同种引起疾病的蛋白质在组织中定位，找到疾病发生的根源，为疾病的治疗提供进一步的线索，这一点在Angelikal.等人的实验中已得到证明。4.6生化反应中酶的检测参与人生理代谢的酶很多，某些酶活性的改变是疾病诊断中不可缺少的指标。对酶活性的测定一直是临床生化检验中重要组成部分。虽然到目前为止还未有直接相关的报道，但由于酶活性检测方法在原理上是相同的，其它类似的研究无疑是启发人们对加强这方面应用的重视。蛋白激酶A是对ATP上磷酸基团转移起重要作用的酶。Cohen用常规的光蚀刻技术制备芯片。酶及底物加到芯片上的小室，在电渗作用中使酶及底物经通道接触，发生酶促反应。通过电泳分离，可得到荧光标记的多肽底物及产物的变化，以此来定量酶促反应结果[15]。在此基础上，又加入特异的抑制物进一步研究了对酶促反应的抑制作用。动力学常数Km的测定表明用该方法研究酶活性是可行的，而且荧光物质在该反应中是稳定的。不久Arenkov进行了类似的实验，他制备的蛋白质芯片的一大优点，可以反复使用多次，大大降低了实验成本。5.蛋白质芯片技术的优点由于蛋白质组学研究的技术需求，蛋白质芯片刚刚兴起就成为研究热点。蛋白质芯片技术的优点主要体现在：1)对生物样品的要求较低，可简化样品的前处理，只需对少量实际标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测，甚至可以直接利用生物材料(血样、尿液、细胞及组织等)进行分析，便于诊断，实用性强；2)能够快速、高通量、定量分析大量的蛋白样品；3)蛋白芯片使用相对简单，全自动化操作，结果正确率较高；4)相对传统的酶标ELISA分析，蛋白质芯片采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好；5)蛋白芯片的所需试剂和样品较少，产品化后，价格更低廉[16]。6.存在的问题及应用前景目前，蛋白质芯片已经应用到生命研究、临床等多个领域，并且取得了大量蛋白质芯片技术研究综述2012-6-19-7-的成果，但是仍有一些问题需要解决，因为相对基因芯片来说，蛋白质芯片的制备及反应过程要复杂得多。无论从蛋白质的合成，还是将蛋白质固定于载体上又要保持蛋白质的活性来说，都存在着许多技术问题。所以蛋白质芯片未来的发展将主要集中在以下几个方面：1