血红蛋白的提取和分离-学案

第-1-页共4页§5.3《血红蛋白的提取和分离》导学案班级：高二（）班姓名：【学习目标】1.概述凝胶色谱法、电泳法分离大分子的基本原理。2.知道缓冲溶液的作用。3.尝试对血液中血红蛋白进行提取和分离,体验从复杂体系中提取生物大分子的基础过程和方法。4.掌握对样品的预处理、色谱柱制作及装填等操作,进行样品的加入和洗脱并最终分离出血红蛋白。【自主学习】一、基础知识1.蛋白质的分离依据:蛋白质特性的差异,如分子的形状和_____、所带_____的性质和多少、溶解度、_________和对其他分子的亲和力等。2.凝胶色谱法:(1)概念:也称做___________,是根据____________________分离蛋白质的有效方法。(2)凝胶的特点形态:微小的_________组成:大多数由_____________构成结构:内部有许多___________(3)常用凝胶:_______和琼脂糖。(4)分离原理。①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程_____,移动速度_____,通过凝胶的时间_____。②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶_____移动,路程_____,移动速度_____,通过凝胶的时间_____。3.缓冲溶液:(1)作用:在一定范围内,缓冲溶液能够抵制______________对溶液pH的影响,维持pH基本不变。(2)配制:通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_________就可以制得____________________的缓冲液。(3)意义:为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程,保持_____________与体内环境中的pH基本一致。4.电泳:(1)概念:带电粒子在_____的作用下发生_____的过程。(2)原理。①带电粒子:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有_______的基团,在一定的pH下,这些基团会带上___________。②迁移动力与方向:在电场的作用下,带电分子会向着与其_____________的电极移动。③分离依据:电泳利用了待分离样品中各种分子________________以及分子本身的_____、_____的不同,使带电分子产生_______________,从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用的电泳方法:___________电泳和________________电泳。第-2-页共4页二、实验操作1.样品处理:(1)红细胞的洗涤。①目的:去除_______。②方法:_______________。③标准:直至上清液不再呈现_____。(2)血红蛋白的释放。(3)分离血红蛋白溶液。①方法:混合液分层。②分层结果(自上而下):第1层:无色透明的_______。第2层:脂溶性物质的_______——白色薄层固体。第3层:_________的水溶液——_____透明液体。第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。③结果处理:将试管中的液体用_____过滤,除去_______沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的_________液体。2.透析——粗分离:(1)过程:取1mL的_________溶液装入_______中,将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的____________中(pH为7.0),透析_____h。(2)原理:透析袋能使_______自由进出,而将_______保留在袋内。(3)目的:去除样品中_________________的杂质。3.凝胶色谱操作——纯化:(1)凝胶色谱柱的制作↓(2)凝胶色谱柱的装填:凝胶用_______充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,_______缓慢倒入凝胶色谱柱内↓①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面_____，关闭出口②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的_____，注意不要破坏凝胶面③加样后：打开下端出口，使样品渗入_______内↓(4)洗脱:_____下端出口,加入磷酸缓冲液,连接______________,_____下端出口,进行洗脱4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定:判断纯化的蛋白质是否达到要求,需要进行___________的鉴定。鉴定方法中,使用最多的是________________________。(3)样品的加入第-3-页共4页三、操作提示1.红细胞的洗涤:_________、离心速度与_________十分重要。洗涤次数过少,无法除去_____蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果。2.色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在_______中膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。3.凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的_________,降低_________。4.蛋白质的分离:如果红色区带__________________,说明色谱柱制作成功。【预习小测】1.相对分子质量较大的蛋白质,无法进入凝胶内部的通道,移动速度较慢。()2.凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。()3.电泳法分离样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。()4.红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白,应快速高速离心。()5.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少。()6.样品处理和粗分离的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。()7.若红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制作成功。()8.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质量和带电性质的差异。()【合作探究】主题1蛋白质的分离原理及方法1.凝胶色谱法：结合上图，说出凝胶色谱法分离不同物质的依据并填表比较蛋白质的运动情况。(1)依据：___________________。(2)蛋白质在凝胶中的运动情况：相对分子质量区别相对分子质量大相对分子质量小运动方式垂直向____运动无规则的_____运动运动速度_____较慢运动路程__________洗脱次序____从凝胶柱中洗脱出来____从凝胶柱中洗脱出来2.电泳：(1)从电荷方面分析适合电泳法分离的各种分子应具备的条件是：各种分子应带有不同_____和不同量的_____。(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？提示：_____。因为SDS能与蛋白质结合，它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的__________，因而掩盖了不同蛋白质间的__________，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的__________决定。主题2血红蛋白的提取与分离实验操作第-4-页共4页1.实验操作：(1)哺乳动物成熟的红细胞适用于进行蛋白质的分离的原因有哪些？提示：①哺乳动物成熟红细胞内没有_________和各种复杂的_________，排除了其他物质对实验结果的干扰。②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。(2)请分析洗涤红细胞的目的，总结判断红细胞洗涤干净的依据。①目的：___________。②依据：_________________________。(3)探究血红蛋白释放过程中蒸馏水和甲苯的作用。①蒸馏水的作用：使红细胞__________，释放细胞内__________；②甲苯的作用溶解_________，有助于血红蛋白的释放。(4)写出分离血红蛋白混合液的结果。第1层(最上层)：_______第2层(中上层)：___________________第3层(中下层)：_______________第4层(最下层)：__________(5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？提示：血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除________________的杂质。2.凝胶色谱操作：(1)在制作凝胶色谱柱时，若凝胶色谱柱的高度不足，则_______________。(2)试从凝胶色谱的分离原理分析凝胶若装填得不够紧密、均匀，则会：在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱_________________________，影响分离的效果。(3)气泡对蛋白质分离产生的影响是____________________________________________。(4)推测样品洗脱时，红色区带可能会出现哪些情况？提示：①如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带_______________________________________；②如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的________有关。【探究总结】提取和分离血红蛋白的过程及目的过程目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的杂质蛋白质混合液分为4层