消毒与灭菌效果的评价方法和标准

中华人民共和国国家标准消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995Evaluatingmethodandstandardfortheefficacyofdisinfectionandsterilization第一篇压力蒸汽灭菌效果评价方法与标准1主题内容与适用范围本方法规定了压力蒸汽灭菌技术标准及其评价灭菌效果的检测方法本方法适用于对压力蒸汽灭菌设备灭菌效果的评价。2试剂本标准所用试剂，凡未说明规格者，均为分析纯(AR)，水为蒸馏水。2.1蛋白胨。2.2葡萄糖。2.3溴甲酚紫酒精溶液：取溴甲酚紫2.0g，溶于100mL95%乙醇中。2.4溴甲酚紫蛋白胨水培养基配制：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，溶于1000mL蒸馏水中，调pH值至7.0～7.2，然后再加2%溴甲酚紫酒精溶液0.6mL，摇匀后，按5mL/管，分装包口，置压力蒸汽灭菌器中，于115℃灭菌40min后备用。3指示菌嗜热脂肪杆菌芽胞(ATCC7953或SSIK31)菌片，含菌量为5×105～5×106cfu/片，121℃下，杀灭90%微生物所需时间D121值为1.3～1.9min，杀灭时间(KT值)为≤19min，存活时间(ST值)为≥3.9min。4化学指示剂需用卫生部批准的化学指示剂。5技术要求压力蒸汽灭菌器压力，MPa/cm2温度，℃灭菌时间，min下排气式0.070115400.10512130预真空式0.2101344-66检测方法6.1生物学指标(用作压力蒸汽灭菌设备灭菌效果的依据)。6.1.1将嗜热脂肪杆菌芽胞菌片两个分别放入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位。6.1.2灭菌柜室内，上、中层中央和排气口处各放置一个标准试验包(由3件平纹长袖手术衣，4块小手术巾，2块中手术巾，1块大手术巾，30块10cm×10cm、8层纱布敷料包裹成25cm×30cm×30cm大小)。手提压力蒸汽灭菌器用通气贮物盒(22cm×13cm×6cm)代替标准试验包，盒内盛满中试管，指示菌片放于中心部位两只灭菌试管内(试管口用灭菌牛皮纸包封)，将盒平放于手提压力蒸汽灭菌器底部。6.1.3经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，56℃培养48h，观察培养基颜色变化。6.2化学指标在物品包外用化学指示胶带，可作为物品是否经过灭菌的处理标志。在物品包内中心部位用化学指示剂，可作为物品是否灭菌的参考标志。7结果判定及评价7.1同次检测中，标准试验包或通气贮物盒内，每个指示菌片接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基全部不变色，判定为灭菌合格。指示菌片之一接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基由紫色变为黄色时，判定为灭菌不合格。7.2化学指示剂的颜色变为与灭菌合格标准色相同时，或熔化时作为灭菌合格的参考标准。第二篇紫外线表面消毒效果评价方法与标准8主题内容与适用范围本方法规定了物体表面消毒用紫外线的波长、强度及评价其消毒效果的物理学指标和生物学检测方法。本方法适用于紫外线直接照射到的物体表面消毒效果评价。9指示菌9.1大肠杆菌(8099或ATCC25922)。9.2枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC9372)。10物理学指标10.1在电压220V时，普通30W直管型紫外线灯，在室温为20～25℃的使用情况下，253.7nm紫外线辐射强度(垂直1m处)应≥70μW/cm2。10.2在电压220V时，高强度紫外线灯，在室温为20～25C的使用情况下，253.7nm紫外线辐射强度(垂直1m处)应≥200μW/cm2。10.3照射剂量按式(1)计算：剂量(μW·s/cm2)＝强度(μW/cm2)×时间(s)………………………(1)11检测方法11.1物理学检测方法11.1.1灯管的紫外线强度(μW/cm2)用中心波长为253.7nm的紫外线强度测定仪(标定有效期内)，在灯管垂直位置1m处测定。11.1.2在实际应用中消毒表面的照射强度应以灯管与消毒对象的实际距离测定。11.1.3表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需。对大肠杆菌，照射剂量应达到20000μW·s/cm2，对枯草杆菌黑色变种芽胞应达到100000μW·s/cm2。11.2生物学检测方法11.2.1采用载体定量消毒试验。载体制备按本标准附录C进行。11.2.2开启紫外线灯5min后，将8个染菌玻片平放于灭菌器皿中，水平放于适当距离照射，于4个不同间隔时间各取出2个染菌玻片，分别投入2个盛有5mL洗脱液(1%吐温80，1%蛋白胨生理盐水)试管中，振打80次。11.2.3经适当稀释后，取0.5mL洗脱液，作平板倾注，每个染菌玻片接种两个，放37℃培养48h作活菌计数。11.2.4阳性对照，除不作照射处理外，取2个染菌玻片分别投入2个盛有5mL洗脱液中振打80次，余按4.2.3进行。11.2.5计算杀灭率阳性对照回收菌数–试验组回收菌数杀灭率（%）=×100······（2）阳性对照回收菌数12判定标准12.1对指示菌杀灭率≥99.9%判为消毒合格。12.2达物理学检测标准时，作为消毒合格的参考标准。第三篇液体消毒剂消毒效果评价方法与标准13主题内容与适用范围本方法具体规定了消毒剂消毒效果生物学检测方法及其评价标准。本方法适用于消毒剂对各种物体的消毒效果评价。14理化指标置20±2℃水浴中，测定在使用浓度下杀灭指示微生物达到消毒或灭菌所需的最短时间(min)。15指示微生物15.1细菌15.1.1细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099或ATCC25922)。15.1.2细菌芽胞：枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC9732)。15.2真菌：白色念珠菌(ATCC10231)。15.3乙型肝炎表面抗原：纯化抗原(1.0mg/mL)。16检测方法16.1中和试验(见附录A)。16.2消毒剂定性消毒试验(见附录B)。16.3消毒剂定量消毒试验(见附录C)。16.4消毒剂杀菌能量试验(见附录D)。16.5乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原性破坏试验(见附录E)。17消毒效果评价标准17.1对细菌和真菌的杀灭率≥99.9%，对HBsAg，将检测方法灵敏度104倍或5×104倍(载体试验)的HBsAg抗原性破坏，可判为消毒合格。17.2对枯草杆菌黑色变种芽胞全部杀灭，可判为灭菌合格。17.3在实际应用中消毒效果评价以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为该消毒剂达到实用消毒所需的浓度和时间。附录A中和剂中和效果试验(补充件)A1内容提要为了准确评价消毒剂对微生物的杀灭作用，消毒试验中要求选择适当中和剂。所选中和剂不仅能及时中止消毒剂的杀微生物作用，且中和剂本身及其与消毒剂的反应产物(下称中和产物)尚需对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基无不良影响。A2培养基和试剂A2.1营养琼脂培养基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g-20g蒸馏水1000mL制法：除琼脂外，其他成分溶解于蒸馏水中，调pH至7.2-7.4，加入琼脂后加热溶解，过滤分装，经121℃、压力蒸汽作用30min，灭菌后备用。A2.20.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.6，下称PBS)。成分：磷酸氢二钠2.84g磷酸二氢钾1.36g蒸馏水1000.00mL制法：将磷酸氢二钠与磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中，pH为7.2～7.4，分装，经121℃、30min压力蒸汽灭菌后备用。A3器材A3.1锥形烧瓶。A3.2平皿(直径9cm)。A3.3量筒。A3.4精密pH试纸。A3.5无菌试管。A3.6无菌刻度吸管(1.0，5.0，10.0mL)。A3.7恒温培养箱。A3.8冰箱。A3.9菌落计数器。A3.10酒精灯。A4中和剂(注明生产厂家，批号)A5操作方法A5.1用PBS将指示菌制成5×105～5×106cfu/mL悬液。A5.2将消毒剂用灭菌蒸馏水配制成3种不同浓度，在不加中和剂的情况下，测知该消毒剂10min抑杀指示菌99.9%以上的最低有效浓度。A5.3取消毒剂10min抑杀指示菌的最低有效浓度与待选择中和剂进行试验，选出中和剂种类并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度，选出试验浓度的消毒剂使用中和剂的浓度。A5.4中和剂选择试验时，先将消毒剂1.0mL与中和剂溶液9.0mL混合，制成中和产物溶液，再按表A1分组进行。表A1中和剂选择试验组号0.5mL菌液加于：混匀作用10min取0.5mL混匀液加入：（加入后总量为5mL）作用10min后，取原液或稀释液0.5mL接种平板（2个/样本）：1消毒剂4.5mLPBS4.5mL原液，×102消毒剂4.5mL中和剂4.5mL原液，×103中和产物4.5mLPBS4.5mL×100，×10004PBS4.5mLPBS4.5mL×100，×10005中和剂4.5mLPBS4.5mL×100，×10006PBS5.0mL原液然后，倾注平板置37℃培养48h，计数菌落数，按稀释倍数计算出回收菌数（cfu/mL）。A6中和试验结果报告方法(如表A2)表A2中和试验结果举例中和剂各组回收菌落数，cfu/mL3、4、5组间误差率，%1234561%卵磷脂07084.67×1064.83×1064.11×10606.271%卵磷脂+0.1%吐温8007945.81×1065.89×1065.78×10600.721%吐温8001943.31×1065.31×1065.21×106018.170.5%硫代硫酸钠01323.20×1065.03×1065.18×106018.943、4、5组间误差率计算公式误差率（%）=[（∣三组均数-3组菌数∣+∣三组均数-4组菌数∣+∣三组均数-5组菌数∣）/（3×三组均数）]×100A7判定标准A7.13、4、5组菌数相似，其误差率≤10%。A7.26组无菌生长。A7.32组菌数明显少于3、4、5组。A7.41组不长菌或明显少于2组。符合上述标准的中和剂表明可消除消毒剂对指示菌的作用，中和剂及其与消毒剂的中和产物对指示菌无毒害，判定为该消毒剂的中和剂。A8消毒试验用中和剂浓度的选择按A5.4步骤进行，按A7.1～7.4的标准判定。附录B消毒剂定性消毒试验(补充件)B1内容提要定性消毒试验是测定受消毒因子作用后的样本有无细菌生长的试验方法。用于对消毒因子灭菌效果的鉴定和消毒剂杀灭细菌效果的初步评价。B2培养基与试剂B2.1普通肉汤培养基B2.1.1成分：蛋白胨10.00g氯化钠5.00g肉浸液1000.00mLB2.1.2制法：取蛋白胨、氯化钠加入肉浸液内，微温溶解，调节pH至弱碱性，煮沸、滤清，调节pH使灭菌后为7.2～7.4，压力蒸汽灭菌备用。B2.2试剂B2.2.1稀释液：含1%蛋白胨的0.03mol/LPBS(pH7.2～7.4)。B2.2.2灭菌蒸馏水。B2.2.3中和剂：按本标准附录A选择。B3器材B3.1灭菌刻度吸管(1.0，5.0，10.0mL)。B3.2灭菌试管。B3.3灭菌三角烧瓶。B3.4酒精灯。B3.5恒温水浴箱。B3.6恒温培养箱。B4试验方法B4.1将菌液进行活菌计数，并用稀释液配制成含菌量为5×105～5×106cfu/mL的菌悬液。B4.2将灭菌试管10支排列于试管架上，标记管号。B4.3每个试管加灭菌蒸馏水2.5mL，放20±2℃水浴中。B4.4于第1管内加适当浓度消毒液2.5mL，混匀后取2.5mL移入第2管，再次混匀，从第2管中取2.5mL移入第3管，以此类推至第9管，混匀后弃去2.5mL，第10管中不加消毒液作对照。B4.5加菌悬液2.5mL于各管中，混匀并记录各管加菌时间，使菌药混合液中含菌量均为105～106cfu/mL。B4.6各管分别于加菌后4个不同间隔时间，取出0.5mL，加入4.5mL中和剂内，中和10min后，取出0.5mL加入4.5mL营养肉汤管内。B4.7将接种细菌的肉汤管放37℃培养48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天。B4.8试验重复5次。B5结果判定B5.1若肉汤管混浊，则表示有菌生长，记为阳性，以(+)表示。B5.2若培养至第7天，肉汤管澄清，