real-time-RT-PCR

实时荧光定量PCR（realtimePCR)原理与实验操作定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析本底期、指数扩增期、平台期Real-timePCR优点特异性好(2%CVofCT值)灵敏度高(5copies)线性关系好、线性范围宽(7-8log)操作简单、安全、自动化程度高、防污染速度快、高通量Real-timePCR概况如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值荧光阈值•在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04•缺省设置：3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍•手动设置：确定荧光阈值的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99阈值的选择ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数初始模板量越多,扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系确定初始模板的浓度理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线.未知10410310610510210SYBRGreen1MolecularBeaconsTaqMan荧光化学物质SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA结合的SYBRGreenI未结合的SYBRGreenIPCRSYBRGreenI工作原理SYBRGreenI优缺点使用方便---不必设计复杂的荧光探针没有序列特异性---可以用于不同的模板便宜灵敏与非特异性产物结合MolecularBeaconsMolecularBeacons发夹型杂交探针MolecularBeacons原理：荧光谐振能量传递（FRET）茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环MolecularBeacons优点对目标序列有很高的特异性——SNP检测最灵敏试剂之一荧光背景低MolecularBeacons缺点设计困难只能用于一个特定的目标价格较高TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补RQ报告基团淬灭基团RQ报告基团被淬灭FRRQ在PCR进行中，探针与目的序列杂交RQ探针在延伸阶段部分解离RQ探针被DNA聚合酶的5’端外切酶活性水解RQ解离的报告基团发出荧光TaqMan工作原理TaqMan优点对目标序列有很高的特异性---特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单TaqMan缺点价格较高只适合于一个特定的目标背景高绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标基因之间的表达差异（不同时相）。采用相对定量法要求所有基因PCR反应的效率要相似，并且最好大于或者等于90%。通过2-△△C（t）计算基因表达的相对变化Real-timeRT-PCR实验操作引物设计试剂订购制备RNA模板和cDNA摸索反应条件制备标准曲线反应计算Real-timeRT-PCR解决方案引物设计实验引物primerSequenceGC%TmProduct(bp)CYP1A1ACATCCGGGACATCACAGACAG64.5664.31172CYP1B161.359.976CYP2B264.2864.94147CYP2E1GCATCACCATTGCCTTGCT62.1861.5586CYC61.959.9265购买试剂提取RNA试剂Trizol逆转录试剂或试剂盒PCR试剂或试剂盒荧光物质逆转录试剂或试剂盒逆转录酶（M-MLV逆转录酶和AMV逆转酶）RNA酶抑制剂dNTPOligoprimer逆转录试剂盒10l×200次TaKaRaCode：DRR033A￥1500PCR试剂或试剂盒Taq酶(HotStart)dNTPPCR试剂盒50l×120次DRR039S￥1600将Taq酶、反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起，是一种2×浓度的PremixType试剂荧光物质SYBRGeenI20×SYBRGeenI500l￥160反映终浓度0.3×～1×Taqman探针2OD￥1500分子信标RNA及cDNA模板制备提取组织或者细胞RNA(纯度1.6)逆转录试剂盒逆转录RNA制备cDNA逆转录反应体系及条件反应体系反应条件42℃15min95℃2minRealtimePCR反应体系反应条件摸索【预变性】【两步法PCR】【三步法PCR】CYC反应条件95℃10s95℃5s62℃15s72℃10s45cycleCYC融解曲线分析60～95℃每一阶步升1℃第一阶步等待15s余阶步等待5s采集信号在sybr通道上HC90.590红HC89.5紫HSC2d90无非特异带CY1A1反应条件95℃10s95℃5s64℃25s45cycle红HC87.3紫HSC7d87无非特异带64度25s红HC87.3紫HSC2d87都有非特异带64度25s66度20s红HSC2d87无紫HSC4d86.3有非特异带CY1B1反应条件95℃10s95℃5s62℃25s45cycleHC88.588.3黄HSC7d86红HC87紫HSC88非特异朱红空白87.3HC、HSC2d1HSC4d、HSC2d288.363度20sHSC2d1、HSC4d88.365度20s标准曲线制备体外转录RNA体外合成ssDNA纯化的质粒dsDNAcDNAPCR产物将待测基因的PCR产物用胶回收试剂盒进行纯化，然后按10倍梯度稀释即可得到标准品，用于做标准曲线。计算相对定量：ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照绝对定量：(Rv=V待测/V参照)需要解决的问题非特异扩增产物假阳性假阴性