ELISA的基本原理和方法

临床ELISA的基本原理和方法及免疫学的发展毛人辉2010.1ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)•酶联接免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay):指以酶作为标记指示物的免疫测定技术，根据其测定中是否需要分离洗涤步骤来分开结合和未结合的抗原或抗体，而分为固相和均相两大类方法。ELISA原理•以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。操作步骤(一)双抗体夹心法(检测未知抗原)•1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。•2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。•3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。••4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。•5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。•6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。(二)间接法(检测未知抗体)用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤ELISA测定的常用模式•常用的ELISA测定模式①双抗体夹心法②间接法③双抗原夹心法④竞争抑制法⑤捕获法（一）抗原测定ELISA模式1.双抗体夹心法对于含多个抗原表位的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的测蛋白抗原的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。2.竞争法（1）先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭。（2）同时加入待测样本和酶标的小分子，温育一定时间后，洗板；此步中，待测样本中的小分子将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合。1（3）加入酶底物，温育，显色测定，显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比（图4）。双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子，测定的灵敏度和特异性均有所提高（图5）。（二）抗体测定模式1.间接法测定机体针对感染性疾病病原体抗原所产生的抗体，在难以得到高纯度且特性明确的抗原以前，或抗原较为复杂的情况下，一般均使用间接法(丙型肝炎病毒抗体)，其基本操作步骤如下。（1）将特异抗原在碳酸盐缓冲液中2~8℃过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。（2）加入含待测抗体的临床样本如血清等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板。此时，待测抗体就会与固相上特异抗原反应而吸附于固相上。（3）加入酶标记的抗人IgG抗体，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成固相抗原－待测抗体－酶标二抗复合物。(4)加入酶底物，温育显色测定（图6）。2.双抗原夹心法类似于双抗体夹心法测抗原（图7），其操作步骤亦基本相同，也可采用类似于双抗体夹心法测抗原模式的“一步法”3.竞争法抗体的测定一般不使用竞争法。当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种模式测定抗体(乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的测定)HBcAb的竞争法测定（1）先将HBcAg在碳酸盐缓冲液中2~8℃过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤，去除未结合的部分及杂质。（2）同时加入待测样本和酶标的特异抗体，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板。此步中，待测样本中的抗体将与酶标抗体竞争与固相上特异抗原结合。（3）加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比（图8）。HBeAb的竞争法测定（1）先将HBeAb在碳酸盐缓冲液中2~8℃过夜包被，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。（2）同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，温育（通常为37℃下）一定时间后洗板；此步中，待测样本中的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原结合HBeAg，待测样本中HBeAb浓度越高，则与固相HBeAb结合的HBeAg越少，反之亦然。（3）加入酶标的特异抗体，温育一定时间后洗板；此步中，酶标抗体将与结合于固相抗体上的特异抗原结合；（4）加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比（图9）。4.固相捕获法（1）首先将抗人IgMμ链抗体于碳酸盐缓冲液中2~8℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部份及杂质。（2）加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗μ链抗体反应而吸附于固相上。（3）加入特异的抗原如甲型肝炎病毒（hepatitisAvirus,HAV）抗原、HBcAg等，温育一定时间后，洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。（4）加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物；(5)加入酶底物，温育显色测定（图10）免疫测定技术最新应用和发展趋势•1896年，Widal发现在一定浓度的伤寒杆菌中加入伤寒病人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验（Widaltest）•1897年Kraus又发现将细菌培养液与其相应的抗血清混合后可发生肉眼可见的沉淀反应•1900年，维也纳大学病理解剖系的年仅32岁的助教Landsteiner发现一些人的血浆能使另一些人的红细胞凝集，这种同种凝集现象的发现，成为人类血型分类的基础，并由此而衍生了生物科学中的一个特殊分支即免疫血液学，Landsteiner也因人类血型的发现获得了1930年的诺贝尔生理学或医学奖•1900年,Bordet又发现了补体结合试验（Complementfixationtest,CFT），即抗原抗体反应后具有补体结合的能力，如红细胞与溶血素反应后，如有补体存在即可出现溶血现象•1906年Wassermann将这种试验用于梅毒螺旋体感染的诊断，建立了著名的用于梅毒血清学诊断的华氏反应。•免疫沉淀和免疫凝集试验属于经典的免疫测定技术，现在仍常用的免疫沉淀试验有单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫固定电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫透射比浊、免疫散射比浊、免疫胶乳增强比浊等；常用免疫凝集试验有间接血凝试验、胶乳凝集试验和明胶颗粒凝集试验等。《临床实验室》常用的免疫检验项目与临床意义都有哪些？（1）病原体抗原和抗体（2）肿瘤标志（3）特定蛋白（4）激素（5）自身抗体免疫测定技术的最新应用•四代丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）测定ELISA方法的发展、可测出HBsAg变异体的ELISA试剂盒的出现、结合液相抗原抗体结合磁性微球固相分离的全自动免疫分析方法（较固相ELISA方法的测定时间大大缩短）、利用胶乳凝集增强敏感性的胶乳增强散射免疫比浊法、均相的克隆酶供体免疫测定(clonedenzymedonorimmunoassay，CEDIA)、西门子公司的均相免疫测定方法发光氧通道试验（Theluminescentoxygenchannelingassay，LOCITM)、流式荧光免疫测定技术（Luminex，又称液相芯片）、蛋白芯片技术