课题1--DNA的粗提取与鉴定

专题5DNA和蛋白质技术汇涓流而成江河，积跬步而致千里。在分子生物学领域，如果没有一项项分子生物学技术的成熟与积累，就没有分子生物学高速发展的今天。从单项技术来看，提取DNA的技术可能平淡无奇，PCR技术也只是重复的扩增某个DNA片段，分离某种蛋白质的工作难免繁琐。但是，正是通过一项项技术上的突破，人类才能完成像人类基因组计划这样恢弘庞大的工程。在本专题中，我们将从基础入手，学习有关DNA和蛋白质的一些技术，或许这就是你迈向分子生物学探究的第一步。课题1DNA的粗提取与鉴定课题背景：当你制作DNA的双螺旋结构模型，模拟DNA的复制，绘制DNA指导蛋白质的合成过程图之后，对DNA的结构与功能一定有了不少的了解。但是，仅仅从课本上了解DNA，就像“雾里看花、水中望月”，总隔着一层。本课题为你提供了从生物体内直接提取DNA的机会。基础知识：提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。首先，让我们来了解这些大分子的物理化学性质。（一）DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCI溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。图5-1是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考下面的问题。1.在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？2.如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。（二）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜（图5-2），但对DNA没有影响。（三）DNA的鉴定在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。实验设计：（一）实验材料的选取什么样的实验材料适合提取DNA？原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。下面的生物材料适合做DNA的提取吗？为什么？你打算选用什么实验材料？你也可以同时用2-3种实验材料，最后比较哪种材料中DNA的含量更高。鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。取材时要注意安全问题，并注意保护环境，不要将珍稀濒危的生物作为实验材料。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。在这一步的设计中，你可以通过设置对照实验来探究生物材料与洗涤剂、食盐用量的最佳比例，看看不同的用量比对结果会产生怎样的影响；你也可以探究用不同的洗涤剂，如洗发香波、沐浴液、洗洁精来提取DNA时，会产生什么不同的效果。为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂。加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么。如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？有条件的话可以用家用搅拌机代替手工研磨。（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的DNA，需要将滤液作进一步处理。下面是去除杂质的三个方案，你可以根据实际情况选用一种，或者自己设计一个方案。方案一利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。具体做法是：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液物质的量浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液物质的量浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？方案二直接在滤液中加入嫩肉粉（图5-3），反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。方案三将滤液放在60~75℃的恒温水浴箱中保温10～15min，注意严格控制温度范围。方案二与方案三的原理有什么不同？（四）DNA的析出与鉴定将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物（图5-4），并用滤纸吸去上面的水分。取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mo1/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加人4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝（图5-5）。操作提示：1.以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。结果分析与评价1.你选用了什么实验材料？你采用了怎样的方法步骤？2.你提取出了白色丝状物吗？用二苯胺鉴定的结果如何？3.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？4.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有什么不同，分析产生差异的原因。二苯胺试剂的配制：称取1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存；临用前在10mL的上述溶液中再加入0.1mL体积分数为0.2%的乙醛溶液。课题延伸本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，与本课题中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。练习1.请解释提取DNA的实验操作中主要步骤的目的。2.你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗？为什么？