何水林版基因工程第五章__基因的转移与重组体的筛选和

第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起单酶切、双酶切第一节DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。（一）直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的连接（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾－碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点（2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接头（adapter）连接法①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接②优点：连上后就能用。③缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。④防止自我连接5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’GGCC-p5’BamHIadapterP--P5’HO-GATCCCGG-GGCCCCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15～20bp与模板互补；5’端内切酶识别序列＋保护碱基避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。写出P1和P2的引物序列。带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’CCTAGGCGCPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’CCTAGPCR产物-5’3’-GGEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA三、PCR产物的连接2.与T载体直接连接三、Gateway载体构建系统噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。入门克隆改造过的各种表达载体三、Gateway载体构建系统（1）创建入门克隆BP反应：attB+attPattL+attR，产物：入门克隆入门克隆改造过的各种表达载体√三、Gateway载体构建系统（2）构建表达克隆LR反应：attL+attRattB+attP，产物：表达克隆入门克隆改造过的各种表达载体√√第二节重组体导入受体细胞一、重组DNA导入大肠杆菌（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（三）转染（transfection）受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。（二）转导（transduction）借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。（一）转化（transformation）（1）热激法（heatshock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化制备感受态细胞增加受体菌细胞膜的通透性（1）热激法①目的感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞制备感受态细胞1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。（1）热激法②CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理10ng载体DNA100L感受态细胞冰浴30min42℃1~2min加入1mLLB培养基（Amp-）37℃振荡培养1h10-100L转化液涂Amp＋平板吸附DNA摄入DNA操作步骤：（p140）转化率：106-108/gDNA（2）电转化法原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。转化率：109~1010/gDNA（二）转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程（三）转染噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106个噬菌斑现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染体外包装过程二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞1.原生质体转化2.碱金属离子介导的完整细胞转化3.PEG1000转化法4.电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞1.利用原生质体进行转化酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2PEG插入外源基因的载体共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转化转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%酵母0.1mol/LLiCl处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个/gDNA；共转化现象极少4.电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/gDNA（3）单链转化率高于双链3.PEG1000转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞1.载体介导的转化（农杆菌介导）2.DNA直接导入（基因抢法、电击法等）3.种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株在饲养平皿的滤纸上培养2天叶盘法的具体操作又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2m钨弹头吸附金属微粒加速，进入受体细胞基因枪装入2.基因枪法（genegun）外植体制备轰击外植体培养及选择具体操作1.DNA微弹的制备2.外植体的制备3.DNA微弹轰击4.外植体的培养植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化3.电击法（电穿孔法）选择培养二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞原理：（三）导入动物细胞1.磷酸钙沉淀法通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。2.脂质体介导法脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖转染法二乙氨乙基（DEAE）+++++++++++++++++++++++DNA-------------------二乙氨乙基（DEAE）+++++++++++++++++++++++葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。4.DEAE-葡萄糖转染法三、转化率及影响因素转化率（cfu/μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。（一）转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/DNA的加入量三、转化率及影响因素例：取1μl（0.1ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？转化率＝1000/0.01ngDNA=108cfu/μg三、转化率及影响因素例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107cfu/mg天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？104＝107cfu/mg×10-2×a×20%重组载体a=0.5mg三、转化率及影响因素普通的亚克隆实验：1×106cfu/μgDNA；更复杂的亚克隆：1×107cfu/μgDNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆；构建文库：1×108cfu/μgDNA。1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度2）受体细胞3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率（二）转化率的影响因素三、转化率及影响因素一、载体表型选择法二、根据插入基因的表型选择三、DNA电泳检测法四、PCR检测法五、核酸杂交检测法六、免疫化学检测法七、DNA序列分析第三节重组子的筛选与鉴定1.抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。一、载体表型选择法2.-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。二、根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长例：抗生素抗性抗性基因载体外源DNA连接转化受体菌抗生素培养基平板含抗生素抗性基因的克隆才能生长使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。1.直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。三、DNA电泳检测法Marker载体重组克隆2.酶切电泳筛选法根据外源DNA序列的限制性酶切图