国家自然科学基金待评审标书

根据以下标书内容回答下列6个问题：1、课题研究的目的是解决科学问题，请说明该课题的科学问题？2、课题立项的理论依据与逻辑推理是否充分必要？3、研究设计能否验证或解决科学问题？4、根据项目前期工作基础判断项目可行性。5、申请人简介如何表述？6、根据评分指标，判定该课题属：好（A）、一般（B）、差（C）。国家自然科学基金申请书摘要：细胞粘附分子T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实T-cad基因在脑胶质母细胞瘤C6细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究T-cad基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标本中研究T-cad基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确T-cad基因失活与临床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导T-cad分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。项目主要参与者与经费预算省略（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系,其发生发展与多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此,进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。T-cadherin分子属细胞粘附分子cadherin超家族。Cadherin超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的Cadherin分子如E-cadherin和N-cadherin由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成，而T-cadherin因缺失经典Cadherin分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名truncated-cadherin（即T-cadherin，又称CDH13或H-cadherin）。近年来对经典的Cadherin分子的深入研究发现，E-，N-cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6,7,8,9,10）。将E-cadherin分子重新导入缺失E-cadherin分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11）。近年已开始有T-cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12,13,14,15,16,17,18），推测T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将T-cadherin基因导入缺失表达T-cadherin分子的大鼠脑胶质母细胞瘤C6细胞使其过度表达T-cadherin分子，C6细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实T-cadherin在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是T-cadherin分子通过诱导P21CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于MolecularandCellularBiology2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究T-cadherin分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21,22,23）。T-cadherin基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致T-cadherin基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24）。T-cadherin基因位于染色体16q24，肝癌的发生与染色体16q24的缺失、突变密切相关(25)。Riou（2002）对位于染色体16q24的13个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherinmRNA在HepG2,PLC/PRF/C,TONG和HA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但T-cadherin基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）进一步研究显示T-cadherin基因启动子在肝癌中高度甲基化，而E-cadherin基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在Cadherin细胞粘附分子超家族中T-cadherin基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性,且T-cadherin基因启动子甲基化与T-cadherin基因失活密切相关（26）。这些研究表明T-cadherin基因启动子甲基化是T-cadherin基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与2ug/ml去甲基化药物5-aza-2’-deoxycytidine共孵6天能使皮肤鳞癌细胞株恢复T-cadherin分子表达（17）。但目前对T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导T-cadherin分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究T-cadherin在肝癌中的基因功能，调查缺失表达T-cadherin的肝癌细胞株重新表达T-cadherin是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示T-cadherin基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导T-cadherin分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究T-cadherin基因与C6细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：1.AngstBD,MarcozziCandMageeAI.Thecadherinsuperfamily:diversityinformandfunction.JCellSci.,2001,114:629-6412.KemlerR.Classiccadherins.Semin.CellBiol.,1992,3:149-1553.KollerE,RanschB.DifferentialtargetingofT-andN-cadherininpolarizedepithelialcells.JBiolChem.,1996,271:30061-300674.TakeichiM.Cadherincelladhesionreceptorasamorphogeneticregulator.Science1991,251:1451-14555.Angst,B.D.,Marcozzi,c.,andMagee,A.L.TheT-cadherinsuperfamily:diversityinfromandfunction.J.CellSci2001,114:629-6416.Berx,G.,and.VanRoy,F..TheE-cadherin/catenincomplex:animportantgatekeeperinbreastcancertumorigenesisandmalignantprogression.BreastCancerRes.2001,3:289-293.7.Bremnes,R.M.,VeveR.,Gabrielson,E.etal.High-throughputtissuemicroarrayanalysisusedtoevaluatebiologyandprognosticsignificanceoftheE-cadherinpathwayinnon-small-celllungcancer.J.Clin.Oncol.2002,20:2417-2428.8.Handschuh,G.,CandidusS.,LuberB.,etal.Tumour-associatedE-cadherinmutationsaltercellularmorphology,decreasecellularadhesionandincreasecellularmotility.Oncogene1999,18:4301-4312.9.Levenberg,S.,YardenA.,KamZ.,etal.p27isinvolvedinN-cadherin-mediatedcontactinhibitionofcellgrowthandS-phaseentry.Oncogene1999,18:869-876.10.AlteredexpressionofE-cadherininhepatocellularcarcinoma:correlationwithgeneticalteration,beta-cateninexpression,andclinicalfeatures.Hepatology2002,36:692-70111.Vleminckx,K.,VakaetL.,MareelJr.M.,etal.GeneticmanipulationofE-cadherinexpressionbyepithelialtumorcellsrevealsaninvasionsuppressorrole.Cell1991,66:107-119.12.RiouP,SaffroyR,ComoyJ,etal.Investigationinlivertissuesandcelllinesofthetranscriptionof13genesmappingtothe16q24regionthatarefrequentlydeletedinhepatocellularcarcinoma.ClinCancerRes.2002Oct;8(10):3178-86.13.Sato,M.,Mori,Y.,Sakurada,A.,etal.TheH-cadherin(CDH13)geneisinactivatedinhumanlungcancer.HumGenet1998,103:96-10114.Lee,S.W.H-cadherin,anovelcadherinwithgrowthinhibitoryfunctionsanddiminishedexpressioninhumanbreastcancer.Nat.Med1996,2:776-78215.Zhong,Y.,Delgado,Y.,Gomez,J.,etal.LossofH-cadherinproteinexpressioninhumannon-smallcelllungcancerisassociatedwithtumorigenicity.Clin.CancerRes2001,7:1683-168716.ToyookaS,ToyookaKO,HaradaK,etal.AberrantmethylationoftheCDH13(H-cadherin)promoterregionincolorectoralcancersandade