灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存

野生型与突变型灰葡萄孢菌的细胞形态观察及菌种保存1.实验目的通过灰葡萄孢菌的培养实验，观察灰葡萄孢菌生长过程中菌丝形态的变化及孢子的萌发过程；通过对灰葡萄孢菌孢子的活化与复壮，保存活力强的菌种。2.实验内容野生型及突变体灰葡萄孢菌的培养、菌丝形态的观察；野生型及突变体灰葡萄孢菌的活化、复壮及保存。3.实验材料3.1实验菌株灰葡萄孢菌是从典型的患灰霉病的番茄上分离并进行了单孢培养，由浙江大学农业与生物技术学院李红叶教授实验室提供；灰葡萄孢菌突变体由本实验室通过紫外诱变获得。3.2仪器电子天平，高压灭菌锅，酸度计，蒸馏水器，超净工作台，恒温培养箱，显微镜3.3试剂PDA培养基：称取马铃薯200g，洗净，去皮，切成小块，加入1000ml水中煮沸30分钟，再用纱布过滤煮过的马铃薯，弃残渣，在滤液中加入蔗糖20g，1.5%琼脂粉，充分溶解，再用蒸馏水定容至1000ml，分装三角瓶，置高压蒸汽灭菌锅中，0.1Mpa的大气压、121℃条件下，灭菌20min，室温冷却待用。4.实验方法与步骤4.1血球计数板的使用血球计数板是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共400小格。(1)将孢子从培养皿的菌丝上洗下来。(2)稀释孢子至每小方格内含有4-5个孢子为宜,一般稀释10倍即可。(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。(4)将稀释后的孢子悬液,用移液器吸取一滴置于盖玻片的边缘,使孢子悬液液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使孢子悬液全部沉降到血球计数室内。(5)计数时,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的细胞数。(6)位于大格线上的孢子,一般只计数大方格的上方和右方线上的孢子(或只计数下方和左方线上的孢子)。(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数。细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数。放大后的计数室4.2野生型灰葡萄孢菌的活化取PDA培养基在超净工作台内倒平板，培养基冷却凝固后将野生型和突变体灰葡萄孢菌的菌种用接种环挑取少量分别放入各个培养皿中，记号笔标记菌种、接种时间，将培养皿放入28℃培养箱中倒置培养，第一次活化时间为一周，待其菌丝变为灰绿色长满平皿后，再按照上述方法进行二次活化。4.3菌株的培养与观察在紫外灯灭菌20min后的超净工作台中，对已制备培养基进行编号，并将已灭菌培养基移取少许置于已备载玻片上制成固体培养基。培养基凝固后将野生型灰葡萄孢菌孢子悬液接种于已置培养基的载玻片上，为防止培养基干燥接种前可用移液枪移取适量灭菌水于培养皿底部滤纸上，用记号笔作标记，记下接种日期与时间，将其置于恒温培养箱（28℃）中进行培养。培养期间每隔12h，重复上述操作，直至第六号培养菌培养12h后，打开培养皿盖，取出载玻片，将1至6号培养菌依次置于显微镜下观察并拍照。观察野生型灰葡萄孢菌孢子萌发、芽管、菌丝和菌落形态。4.4灰葡萄孢菌孢子悬液的制备活化后的灰葡萄孢菌再培养7天（28℃），待菌体产生孢子即可。用无菌水洗菌体数次得到孢子悬液，孢子悬液用血球计数板计数，将孢子悬液的浓度稀释到2×105个孢子/ml待用。4.5灰葡萄孢菌的复壮选取四个大小相近、相对成熟、无损伤的番茄，在超净工作台内用解剖刀分别撕去一平方厘米区域大小的表皮，并在这些区域用分别接野生型和突变体灰葡萄孢菌孢子悬液，用记号笔分别标记（野生型CK,突变体TG)。找一长方体或正方体盒子，去掉盖子用细线将其缠绕形成网状顶部，取适量无菌水倒至底部，将接有孢子悬液的番茄置于其网状顶平面，保鲜膜将其密封，于28℃下培养二至三天，观察菌种生长情况，并拍照。5实验结果通过观察野生型灰葡萄孢菌在培养基上的萌发状态，发现野生型灰葡萄孢菌生长12h萌发长出单极性芽管，24h菌丝分支，36h后长满菌丝，分支增多，48h时形成分生孢子头，部分开始散发分生孢子，60h时散发分生孢子，72h时分生孢子散发完，部分还在散发分生孢子（图1）。通过观察不同时段野生型灰葡萄孢菌在培养基上的菌落生长状态，发现24h时培养基上无肉眼可见菌落长出，36h时有明显的菌落长出，48h长满整个培养基，60h长至培养基边缘，72h有更多菌丝长出，菌落颜色加深（图2）。野生型和突变体孢子侵染番茄，置室温下均有菌丝长出，说明两类孢子均具有侵染活性（图3）。12h24h36h图1野生型灰葡萄孢菌不同时段的细胞生长形态图2野生型灰葡萄孢菌不同时段菌落生长形态图3野生型和突变体灰葡萄孢菌侵染番茄48h60h72h12h24h36h48h60h72hAB