《生物化学教学课件》第十一章-核酸的生物合成--演示文稿x

第十章核酸的生物合成第一节DNA的生物合成一．DNA的半保留复制1953年，Watson与Crick共同提出了DNA双螺旋模型，并就其复制过程进行了推测：DNA在其复制过程中，碱基之间的氢键要断裂，双链要解旋分开；每条单链各自作为模板，在其上合成新的互补链，从而产生两条新的DNA双链，它们保持了原DNA链上的碱基顺序。因此，DNA的复制过程就是一个半保留复制的过程。1958年，Meselson与Stahl利用N的同位素标记，首先证明了DNA的复制过程的确就是一个半保留复制的过程。他们先使大肠杆菌长期在以15NH4CL为唯一氮源的培养基中生长，使其DNA全部变成15NDNA。然后再将细菌转入普通培养基（含14NH4CL）中，并将各代的细菌DNA抽提出来进行氯化铯密度梯度离心。半保留复制在DNA的复制过程中，在酶的催化作用下，碱基之间的氢键要断裂，双链要解旋分开；按照碱基配对原则，以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物，每条DNA单链各自作为模板，在其上合成新的互补链，从而产生两条新的DNA双链，新的DNA双链保持了原DNA链上的碱基顺序。参考•DNA复制（replication）DNA复制是指以亲代DNA分子的双链为模板，按照碱基配对的原则，合成出与亲代DNA分子相同的两个双链DNA分子的过程。1．半保留复制是双链DNA复制的普遍形式；2．即使是单链DNA分子，其复制过程中也要先形成双链的复制型（RF）;3．要求原DNA双链解开，每一单链为模板，依碱基配对原则，合成另一条互补链。关于“模板”的定义模板：能提供合成一条互补链所需精确信息的核酸链。有学者提出，模板的定义宜为“用于合成（另）一种大分子所用的大分子模型”；也有学者提出，模板的定义宜为“能提供合成（另）一种大分子所需精确信息的大分子模型”；4．复制、转录及逆转录，在形成双螺旋分子时均需碱基配对；5．碱基、核苷、核苷酸单体之间不形成碱基对，而只是在双螺旋时因空间关系而形成。6．DNA半保留复制机制可说明DNA在代谢上的稳定性。经许多代复制后，DNA的多核苷酸链仍保持完整，并于后代不被分解。DNA较细胞的其它成份要稳定得多。二．复制的单位（一）复制子1．复制子复制子指基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都含有控制复制的起点，可能还有终止复制的终点。复制过程是在起始阶段受到控制的。一旦复制开始，即进行下去，直到整个复制子完成复制。2．复制叉复制时DNA双链在起点处会形成叉子样的结构，此即复制叉。随复制叉的移动，完成DNA的复制过程。因此，复制叉也被认为是DNA复制的“生长点”。由于DNA复制时会形成复制叉，导致DNA双链在其解链区域看起来象一个泡状结构或象一只眼睛，故有时又将此泡状结构称作“复制泡”或“复制眼”。3．原核生物染色体DNA只有一个复制子原核生物染色体DNA在其复制时，一般是头一次复制尚未结束，就又在新生链的复制子的起点开始新一轮复制。E.coli的DNA复制一次需40min。但在迅速生长的原核生物中，第一次复制尚未完成，第二次复制就在同一个始点上开始，从而，使原核生物可以用更快的速度繁殖。就单个的复制叉的移动速度而言，原核生物的较真核生物的移动要快但由于原核生物染色体DNA只有一个复制子，而真核生物染色体DNA却有多个复制子，因此真核生物染色体DNA复制的总速度反而比原核生物染色体DNA复制的总速度要快。在真核生物染色体的不同位置上有多个复制起点，如在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有2000——3000个复制起点。从这些起始点开始向相反方向复制，就形成多个复制泡。这一状况已用电子显微镜观察得到证实。4．复制子的大小并非绝对不变，这因生物种类而异，也与生长条件、染色体结构等因素有关，且同一DNA分子上不同复制子的大小不均一。（二）复制的方向复制的方向可以朝一个或两个方向进行。这是由在复制的起点形成的复制叉的个数决定的：如果形成一个复制叉，则复制的方向是一个，这时的复制也就是所谓的“单向复制”；如果形成二个复制叉，则复制的方向是二个，这时的复制也就是所谓的“双向复制”。复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向原核生物的染色体与质粒DNA、真核生物的细胞器DNA均为环状的双链分子，它们都在一个固定的起点开始复制，大多数为双向的。复制一般是对称的，即两条链同时开始复制。但是，有些则否，即一条链复制后再进行另一条链的复制。三．原核生物DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）（一）DNA的聚合反应1956年，Kornberg首先从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶，此后在不同的生物中都找到了DNA聚合酶。1.DNA的聚合反应的条件（1）DNA模板；（2）底物dNTP(N=A,G,C,T)；（3）DNA聚合酶及其活性所需要的Mg2+；酶的活性部位紧密结合Zn2+；（4）与模板DNA互补的一小段多聚核苷酸引物，要露出其3`-OH。引物一般为RNA。但是少数情况是DNA或tRNA。2.聚合反应n1dATP+n2dGTP+n3dCTP+n4dTTP+DNA（模板）————DNA-(n1dAMP-n2dGMP-n3dCMP-n4dTMP)+(n1+n2+n3+n4)PPi3．聚合反应的机理引物上的3`-OH对进入的底物dNTP(N=A,G,C,T)上的α-P进行亲核攻击，形成3`，5`-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。所需能量来自α-与β-磷酸基之间的高能键的断裂。而进入的底物dNTP上的碱基要与模板上相应的碱基配对则是DNA聚合酶催化反应进行的前提。4．聚合反应的特点（1）只能以dNTP(N=A,G,C,T)为底物，而不能是dNDP或dNMP(N=A、G、C、T)；（2）要有模板的指导，并遵守碱基配对原则；（3）要有引物及其上的3`-OH存在；DNA聚合酶只能催化dNTP加到引物上的3`-OH上，而不能使dNTP自身发生聚合。（4）DNA链的生长方向为5`——3`。（5）产物的性质与模板的相同。以不同来源的DNA为模板，同样引起和促进新的DNA的酶促合成。产物DNA的性质完全不取决于DNA聚合酶的来源，也与四种脱氧核苷酸的比例无关，而仅仅取决于DNA模板。产物DNA与模板双螺旋DNA具有相同的碱基组成，也就是说DNA聚合酶能使两条模板DNA链都进行复制。（二）DNA聚合酶1．DNA聚合酶I大肠杆菌中共有三种DNA聚合酶，这是由Kornberg首先从大肠杆菌中提取的，也是人类发现的第一个DNA聚合酶，也叫Kornberg酶。（1）只有一条多肽链，分子量为109，000，活性部位含有Zn；ThesearchforanenzymethatcouldsynthesizeDNAbeganin1955.WorkbyArthurKornbergandcolleaguesledtothepurificationandcharacterizationofDNApolymerasefromE.colicells,asingle-polypeptideenzymenowcalledDNApolymeraseI(Mr103,000;encodedbythepolAgene).Muchlater,investigatorsfoundthatE.colicontainsatleastfourotherdistinctDNApolymerases.（2）是多功能酶，主要具有以下功能。a．5`—3`聚合酶活性催化DNA链的合成延长。与其它DNA聚合酶一样，只能催化DNA链的延长，而不能启动DNA链的合成。b．3`—5`核酸外切酶活性此即从3`端向5`端水解DNA链的活性。当酶与模板结合时会引起酶构象的变化，使酶能够正确识别进入的底物核苷酸与模板核苷酸之间的碱基配对与否。一旦在合成过程中有错误的核苷酸掺入而不能与模板链上的碱基配对时，此酶便可用其3`—5`核酸外切酶活性将错误的核苷酸切除而保证正确合成DNA链。因此，该功能也被认为是“校正功能”。该酶的3`——5`外切酶活性只对单链而不是双链的3`-端起作用在正常的聚合条件下，该活性受到抑制，而当碱基配对出现错误时，该酶的聚合反应停止，而3`—5`核酸外切酶活性出现并切除错配的碱基，然后此外切酶活性停止而恢复酶的聚合酶活性以继续合成DNA链。可见，在DNA复制的时候，碱基配对受到双重的核对：聚合酶对碱基的选择作用和3`—5`核酸外切酶活性对错配碱基的校正作用。c.5`—3`核酸外切酶活性从5`端向3`端水解DNA链而得到核苷酸或寡核苷酸它只作用于双链DNA中的单链。有时还可以跳过几个核苷酸起作用，如切除紫外照射引起的嘧啶二聚体。该酶一般在切除引物或修复DNA损伤时起作用。它也被称为修复酶。有学者提出该酶在DNA成熟过程中起作用。d.将DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶有限水解可以得到分子量分别为75，000和36，000的两个片段。大片段具有聚合酶活性与3`—5`核酸外切酶活性；小片段则具有5`—3`核酸外切酶活性。ProteasecleavageDNApolymeraseIhasthreeenzymaticactivitiesinasinglepolypeptidechain,whichcanbecleavedintotwofunctionalpartsbymildproteasetreatment.2.DNA聚合酶II只有一条多肽链，分子量120，000有5`—3`聚合酶活性和3`—5`外切酶活性（即具有校正功能），但无5`—3`外切酶活性。该酶催化合成DNA的特点与DNA聚合酶I基本相同。需要Mg2+、NH4+的激活。如果要使其催化DNA合成的速度达到最大，则需要有缺口的双链DNA为模板-引物，且此缺口需约长达50-200bp（似应为核苷酸？）。此缺口不能过大，否则酶活性会下降。该酶也不是复制酶，而是修复酶。3.DNA聚合酶III目前认为它是大肠杆菌细胞中真正负责催化DNA链的合成延长的酶。具有多个亚基。是多功能酶。有5`—3`聚合酶活性；有3`—5`外切酶活性（即具有校正功能）；无5`—3`外切酶活性。•它与DNA聚合酶II都最适宜作用于带有小片段缺口（小于100bp）的双链DNA，而DNA聚合酶I则最适宜作用在具有大段单链区的双链DNA乃至于带有很短引物的单链DNA。原核生物DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ功能5´3´聚合活性+++3´5´外切酶活性+++5´3´外切酶活性+--分子量109000120000140000每个菌体中所含的酶分子数4004020聚合速率（核苷酸数/分/酶）100060000滞后链合成的模板形成环，复制叉上的二聚体DNA聚合酶Ⅲ全酶同时合成两条子链。（三）DNA连接酶DNA聚合酶只能催化DNA链的合成延长，并不能催化DNA链之间的连接催化连接两条DNA链的功能由DNA连接酶来行使。I.E（哺乳动物与噬菌体感染的大肠杆菌）+ATP=E-AMP+PPiE（大肠杆菌）+NAD+=====E-AMP+NMNII.E-AMP+3`A——T———G——T5`5`T——A-OHP-C——A3`A——T—————-G——T5`=====5`T——A-OHAMP-P-C——A3`•III.3`A——T—————G——T5`5`T——A-OHAMP-P-C——A3`======3`A-T-G-T5`5`T-A-C-A3`DNA连接酶催化DNA双链之切口处的5`-磷酸基与3`-羟基之间形成3`，5`-磷酸二酯键。对切口处的核苷酸残基是什么碱基组成DNA连接酶并无要求，而只要求切口处的5`-磷酸基与3`-羟基应当位于相邻位置。在反应中要消耗能量，在大肠杆菌中由NAD+提供，而哺乳动物与噬菌体感染的大肠杆菌中则由ATP提供。DNA连接酶不能连接游离的两条DNA。T4DNA连接酶则可以作用于上述切口处，而且可以连接无单链粘性末端的平头双链DNA，但是不能连接游离的单链DNA。（四）DNA的半不连续复制1.半不连续复制和冈崎片段（1）半不连续复制DNA双链在其复