利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展

应用与环境生物学报2009，15(4):579~584ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2009-08-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2009.00579以木质纤维素为原料的第二代生物质燃料开发既是全球研发的热点也是难点.欧盟国家和美国的中长期生物质能源发展路线图中均将木质纤维素生产燃料乙醇作为2010年后生物质燃料产业化的主要目标，但是目前整体水平尚处于中试阶段.我国的纤维素类生物质原料非常丰富，将其转化成燃料乙醇有着很大的潜力，但当前要想实现工业化生产，还面临着很多瓶颈问题亟待解决，主要体现在：1)对于原料的生物质能转化特性和转化机制尚缺乏充分的基础研究；2)还没有形成高效的组分分离技术(预处理技术)；3)生物炼制技术尚处于起步阶段，还需要大量基础性实验和理论研究.4)缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物(主要为葡萄糖和木糖混合物)的发酵菌株，这是制约纤维素乙醇生产的关键因素[1].李科等对木质纤维素生物质制取乙醇的预处理、酶解和发酵等三大关键制约因素进行了较为全面的综述，为木质纤维素生产乙醇提供了新的研究思路[2]，在此不再赘述.孙宪昀等就国内外对青霉菌木质纤维素降解酶系研究的最新动态，包括菌株的选育、纤维素酶系的特性与合成调控，以及基因分析与克隆等方面对木质纤维素的生物降解进行了综述[3].本文主要针对高效利用纤维素水解物的重组发酵菌株这一关键因素进行探讨.目前对于利用木质纤维素生产乙醇的菌种研究主要集中于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等.在乙醇工业中通常使用酿酒酵母来发酵生产乙醇，但酿酒酵母不能发酵大量存在于纤维素水解物中的五碳糖；革兰氏阴性细菌运动发酵单胞菌由于其本身所具有的优点也被作为一种候选的燃料乙醇生产菌株，但也不能直接发酵五碳糖.所以研究者一直致力于通过基因工程的手段来解决发酵菌株对利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展*何明雄1,2祝其丽1,2潘科1,2胡启春1,2**(1农业部沼气科学研究所生物质能技术研究中心成都610041)(2农业部能源微生物与利用重点开放实验室成都610041)ProgressinEthanolProductionwithLignocellulosicBiomassbyDifferentRecombinantStrains*HEMingxiong1,2,ZHUQili1,2,PANKe1,2&HUQichun1,2**(1ResearchCentreofBiomassEnergyTechnology,BiogasInstituteofMinistryofAgriculture,Chengdu610041,China)(2KeyLaboratoryofEnergyMicrobiologyandApplication,MinistryofAgriculture,Chengdu610041,China)AbstractEthanolfermentationwithlignocellulosicbiomassinvolvessignificantlygreatchallenges,owingtolackofindustriallysuitablemicroorganismsforconvertingcellulosehydrolysatesintofuelethanol,whichhastraditionallybeenconsideredasamajortechnicalroadblocktothedevelopmentofbioethanolindustry.Currently,differentrecombinantstrainshavebeenengineeredtoproduceethanolfromlignocellulosicbiomass.ThegreatestsuccesseshavebeenmadeintheengineeringofSaccharomycescerevisiaeandsomeotherbacteria,includingEscherichiacoli,Klebsiellaoxytoca,andZymomonasmobilis,whichprovideabasisforconstructingindustriallysuitableengineeredstrainsforcelluloseethanolindustrialization.Thisreviewsummarizesrecentprogressinthisfiled,andalsoprospectitintheOmicera.Fig2,Tab2,Ref51Keywordslignocellulose;biomass;bioethanol;Saccharomycescerevisiae;Zymomonasmobilis;Escherichiacoli;KlebsiellaoxytocaCLCQ936:TK6摘要要实现木质纤维素类生物质的有效利用，当前还面临很多瓶颈问题亟待解决，而缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物的发酵菌株是制约纤维素乙醇生产的最关键因素.目前对发酵菌种的研究主要集中在酿酒酵母、运动发酵单胞菌、大肠杆菌和克雷白氏杆菌这4种菌上，已取得大量研究进展，为纤维素乙醇的产业化奠定了一定的基础.本文综述了这4种菌发酵纤维素水解物的基因工程改造研究进展，并对组学时代进一步优化发酵菌株进行了展望.图2表2参51关键词木质纤维素；生物质；燃料乙醇；酿酒酵母；运动发酵单胞菌；大肠杆菌；克雷白氏杆菌CLCQ936:TK6收稿日期:2008-12-12接受日期:2009-03-02*中国农业科学院科技经费项目(2009)资助SupportedbytheSci&TechProjectoftheChineseAcademyofAgriculturalSciences(2009)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])58015卷应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol五碳糖(特别是木糖)的发酵问题，大肠杆菌和克雷白氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)由于具有较宽的底物利用范围引起了研究者的关注.本文主要对这几种目前用于木质纤维素生物质发酵产生乙醇的菌种进行较为全面的综述.1重组酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)传统的乙醇发酵生产菌株酿酒酵母由于缺少木糖利用的最初代谢途径，不能直接利用木糖，而只能利用其异构体——木酮糖.自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有2条(图1).在真菌中，木糖通过木糖还原酶(Xylosereductase，XR或XYL1)和木糖醇脱氢酶(Xylitoldehydrogenase，XDH或XYL2)的共同作用来完成木糖到木酮糖的代谢转化过程；而在细菌中，则是通过木糖异构酶(Xyloseisomerase，XI)一步转化为木酮糖[4].目前主要通过以下2种思路构建直接利用木糖的重组酵母菌：1)将来自木糖利用酵母(目前主要是Pichiastipitis)的XR和XDH基因在酿酒酵母中表达；2)将来源于细菌的木糖异构酶(XI)在酿酒酵母中表达.1.1XR-XDH代谢途径的运用将毕赤酵母的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2克隆到酿酒酵母中，转化子能在以木糖为唯一碳源的培养基上缓慢生长，但所利用的木糖全部被氧化形成木糖醇，乙醇产率相当低[5].将木酮糖激酶基因XKS1(XYL3)克隆到已含有XYL1和XYL2基因的酿酒酵母转化子中，可使木糖醇的产率降低，乙醇产率明显提高[6,7].副产物木糖醇的形成原因可能是木糖代谢途径下游不畅及氧化还原不平衡，目前也通过改变下游代谢途径的氧化还原平衡来增加乙醇的产率[8,9].另一方面也可通过敲出某些关键基因(如GRE3等)[10]来实现这一目标.国内袁振宏和杨秀山等也通过代谢途径过程构建了重组木糖利用酵母，并就木糖运输途径的改造、木糖代谢途径的引入、增强其对发酵抑制剂的耐受性等方面进行了全面综述，提出了酿酒酵母的木糖代谢工程还有待于进一步深入研究[11].此外，Walfridssion等在木糖酵母中超表达磷酸戊糖途径的转酮酶(Transketolase，TKL)和转醛酶(Transadolase，TAL)可以增加木糖转化为乙醇的量[12].目前较为成熟的菌种有S.cerevisiaeTMB3400、S.cerevisiaeRWB218和S.cerevisiaeRE700A(pKDR)等(表2).1.2细菌XI代谢途径的运用多种细菌来源的XI被引入酿酒酵母中[13]，沈煜等也将来源于嗜热细菌Thermusthermophilus的木糖异构酶基因xylA引入酿酒酵母[14]，但来源于Piromycessp.的XI所得到的活性最高[15]，只有通过适应性进化[16]或其他的遗传改造[17]方能使其代谢木糖的能力得到提高.从整体上看，采用细菌木糖代谢途径还存在着重组酶表达活性较低和细菌木糖异构酶的最适反应温度与发酵温度不同等问题，也有研究者通过突变的方式来解决这一问题.并且该途径与XR-XDH的发酵比较研究表明，采用XR-XDH代谢途径所构建的重组菌株S.cerevisiaeTMB3400较细菌XI代谢途径发酵效率高，且在发酵纤维素水解物时没有副产物木糖醇的生成[13].1.3细胞表面展示技术的应用近年来发展起来的酵母表面展示技术也被用于构建酵母基因工程菌上，如YasuyaFujita等应用酵母展示系统展示图1真菌(A)和细菌(B)中的木糖代谢途径Fig.1Metabolicpathwayofxyloseinfungus(A)andbacterium(B)表1纤维素水解酶基因和五碳代谢途径相关基因在运动发酵单胞菌中的表达Table1ExpressionofcellulasegeneandpentosemetabolicpathwayofZ.mobilis底物Substrate基因Gene基因来源Sourceofgene参考文献Reference纤维素Cellulose内切葡聚糖酶Endoglucanase内切葡聚糖酶Endoglucanase内切葡聚糖酶Endoglucanaseβ-(葡萄)糖苷酶β-glucosidase羧甲基纤维素酶Carboxymethylcellulase菊欧文菌Erwiniachrysanthemi枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis萤光假单胞菌Pseudomonasfluorescens白纹黄单胞菌Xanthomonasalbilineans醋酸杆菌Acetobacterxylinum[21]木糖Xylose木糖异构酶Xyloseisomerase木酮糖激酶Xylulokinase透明质酸酶Alidase野油菜黄单胞菌Xanthomonascampestris[27]木糖异构酶Xyloseisomerase木酮糖激酶Xylulokinase转二羟丙酮基酶Transaldolase酮糖移转酶Transketolase大肠杆菌Escherichiacoli[28]阿拉伯糖(Arabinose)L-阿拉伯糖异构酶L-arabinoseisomerase核酮糖激酶Ribulokinase转二羟丙酮基酶Transaldolase5-磷酸核酮糖异构酶5-phosphoribuoseisomerase酮糖移转酶Transketolase大肠杆菌E.coli[25]5814期何明雄等：利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展两种纤维素酶，构建了一株不经过前处理而直接发酵β-葡聚糖生产乙醇的重组酵母菌基因工程菌，通过此系统构建的重组酵母工程菌，糖化作用和发酵同时发生，在以β-葡聚糖为唯一碳源的培养基中，能在50