单克隆抗体制备的技术

单克隆抗体制备平台建立尹芝南美国耶鲁大学医学院副教授南开大学生命科学学院院长基本概念抗原决定镞（抗原表位）细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体Antigenicdeterminant是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团Polyclonalantibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体Monoclonalantibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体Ab1Ab3Ab4单克隆抗体抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）脾B细胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤细胞HAT培养，稀释单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图杂交瘤细胞+PEG,融合杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT2.主要途径：氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT选择培养基的原理HAT选择培养基组分次黄嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)脾抗原免疫的脾细胞(B细胞)小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)1.抗体分秘(IgG+)1.具永生性2.HGPRT+在HAT生长2.8AG筛选出HGPTP-株PEG融合HAT筛选脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（HGPRT+、Ig+）融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞免疫动物培养骨髓瘤细胞收集致敏的B淋巴细胞收集骨髓瘤细胞细胞融合HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞检测筛选阳性细胞克隆化培养（反复3-5次）获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）McAb纯化及鉴定制备单克隆抗体的基本技术1抗原提纯与动物免疫2骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备3细胞融合4抗体检测5杂交瘤的克隆化和冻存6McAB的制备7单克隆抗体的纯化免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次)冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％融合比例脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞一般在融合前一天制备免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液2周后改用HT培养液2周后,改用一般培养液一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。单抗纯化方法：盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法单克隆抗体特性理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备单克隆抗体在医学中的应用检验医学诊断试剂（1）病原微生物抗原抗体的检测（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定（5）细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术基因工程抗体与抗体库技术单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。单克隆抗体药物概况单克隆抗体（MAB）是近年来复合年增长率最大的一蛋白类药物，2001年全球销售额增长了57.3%，接近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗药物方面。预计到2010年用于癌症治疗的单克隆抗体将占其销售总额的54.7%。据预测，单克隆抗体将会以复合年增长率16.3%的速度增长，到2010年达到121.39亿美元的市场规模。其中，治疗癌症的单克隆抗体市场规模将达66.36亿美元。抗体的人源化技术进展:•单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。•单抗将发展成为一大类独立医药产品。•鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代:原因：1.鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，2.CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱；3.与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱；4.鼠源抗体半衰期短，发挥ADCC与CDC作用的时间较短；5.鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。鼠抗体人源化的构建方法:嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应HAMA。表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换:互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。重构抗体：由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移。全人源化抗体完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。2.1抗体库筛选技术:抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因；PCR扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先导系列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。基因工程小鼠制备全人抗体全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠（hu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠：将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单抗技术。不足之处：(1)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导致不十分完全的人序列；(2)由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；(3)转基因小鼠表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。转染色体小鼠：通过微细胞介导法（MMCT方法）将人14号染色体上产生IgH的胚系片段和2号染色体上5～50Mb的κ轻链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后，可产生抗人血清白蛋白的人Ig，再次免疫后IgM产生。由转染色体技术得到的小鼠，表达的人IgG各亚类的量与人血清中表达的IgG各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但是，转染色体小鼠导入的人Ig片断虽然比较大，但其表达的人Ig量却比较低。转染色体牛:产生人Ig转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人Ig轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步发育成转染色体牛。产生人Ig转染色体牛的构建特点在于：(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系，因此将人人工染色体导入牛胚胎成纤维细胞；(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人HAC的微细胞与牛胚胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d，因此必须经过2次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。ThanksforattentionThanksDec.5.2007摄于新疆喀纳斯湖2005.8.18