《超分辨率荧光显微成像技术》

点扩散函数工程超分辨率显微成像技术(STED/RESOLFT)光激活定位显微技术(PLMA)近场光学成像技术(NSOM)超分辨率荧光显微成像技术点扩散函数工程超分辨率显微成像技术•一个典型的STED显微系统中有两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。由于在受激发射过程中所发出的荧光和自发荧光的波长及传播方向均不同，因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的分辨率。(a)STED显微术的基本超分辨原理;(b)受激发射过程中的非线性效应10．3969/j．issn．1007-7146．2013．02．002紫色代表的是激发激光，黄色代表的是用来受激发射损耗的激光，两束激光经过时间空间调制后同时照射在样本上由右图可以看出激发光光斑（紫色）经STED激光（黄色）的调制后极大的减少了激发的荧光分子的光斑大小(绿色），其半高宽可以达到66nm.Nature,2006,440(7086):935～939点光源光斑的半高宽•其中I是STED激光器的最大聚焦强度，而Isat则是当受激荧光强度被减少到1/e时的STED激光的强度特征值。由此公式可看出，当I/Isat的值趋近无穷大时，STED成像的点光源的半高宽趋近于0，即分辨率不再受光的衍射过程所限制。Nature,2006,440(7086):935～939(a)Confocalimageoffluorescentnanoparticles;(b)STEDimageoffluorescentnanoparticles;(c)Confocalimageofhumanneurofilament;(d)STEDimageofhumanneurofilament•STED的缺点：STED成像的主要缺陷在于光路复杂，设备昂贵，对系统的稳定性要求很高。•STED的优点：成像速度快，可以快速地观察活细胞内实时变化的过程。光激活定位显微技术的基本原理PALM光激活定位显微技术的基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位。将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术。Science,2002,297(5588):1873～1877原理Science,2006,313(5793):1642～1645PALM技术局限性PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力．PALM技术的改进三维PALM成像技术散光原理成像基于单荧光分子显微成像的PALM和STORM技术可以通过多种方法来改进其在z轴上的分辨率。一种方法是利用散光的原理来提取z轴方向上的精细信息．具体的方法是在成像物镜和图像透镜之间加上一个散光的柱面镜，从而产生xy轴向上的光程差。当点光源位置正在聚焦平面时，其投射到CCD上的光斑与正常的显微镜一样，都是一个四面对称的圆形。而当点光源位置不在聚焦平面时，其投射到CCD上的点扩散光斑会呈现椭圆形状，其椭圆长轴的指向和长度分别决定了点光源位置在聚焦平面的上下以及离聚焦平面的距离。Science,2008,319(5864):810～813ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(9):2995～2999a.利用柱面镜增强PALM在z轴分辨率b.利用液晶空间光调制器增强PALM在z轴分辨率多重平面成像三维成像的另一种办法是将两个或者多个不同聚焦层面的图像同时送入CCD中，提取三维信息。利用这个原理，Hess和Bewersdorf小组开发出来双层PALM技术．NatMethods,2008,5(6):527～529前景超分辨率荧光显微成像技术将显微技术带入“纳米”领域，让人类能够“实时”观察活细胞内的分子运动规律，为疾病研究和药物研发带来革命性变化。利用超高分辨率显微镜，可以让科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子、细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。Reversiblesaturableopticalfluorescencetransition（RESOLFT）样品被均匀地照射，与经典分辨率极限相比，光的强度是降低的。但是理想状态下，在一个位置是没有光的。分子切换到暗状态所需的阈值强度（蓝线）只有所施加的最大强度的一小部分，因此，只有分子非常接近最小强度的位置可以是在明亮状态。右边的框所示的绿色区域说明了分子能够产生信号的区域的大小。在RESOLFT显微镜，发色团可以用405nm的光使其敏化，随后通过491nm的光使中心强度为零，这样就可以在外围有荧光转换为非荧光的状态。这样只有靠近中心的分子保持荧光状态，而且可以通过它们的发射被检测到。Angew.Chem.Int.Ed.Engl.51,1312e1314.AdvatangeandDisadvantage•RESOLFT能够反映出样本的细节，而传统共焦显微镜做不到。•这种“耐疲劳”可切换的探针虽然可以在荧光和黑暗状态之间来回切换很多次,但仍然有限,大大妨碍了使用RESOLFT在生物成像的应用。近场光学成像技术传统的光学理论，如几何光学、物理光学等，通常只研究远离光源或者远离物体的光场分布，一般统称为远场光学。远场光学在原理上存在着一个远场衍射极限，限制了利用远场光学原理进行显微和其它光学应用时的最小分辨尺寸和最小标记尺寸。而近场光学则研究距离光源或物体一个波长范围内的光场分布。在近场光学研究领域，远场衍射极限被打破，分辨率极限在原理上不再受到任何限制，可以无限地小，从而基于近场光学原理可以提高显微成像与其它光学应用时的光学分辨率。1.远场光学的衍射分辨极限雷利判据r=1.22λ/2NA=0.61λ/NATheRayleighcriterion①choosingveryshortwavelengths(UV,xradiationinthecaseofelectromagneticfieldsormoreefficiently,propagatingelectrons);②workinginveryhighindexmaterialsforincreasingn.increasingtheapertureangleofthemicroscopeFieldemittedfromanobject在物体表面的近场光包含两种成分，①可以向远处传播的传播场；②被局域在物体表面，在物体之外迅速衰减的非辐射隐失场。隐失场是非均匀场，其性质与样品的性质和结构有密切关系。这种场因物质的存在而存在，不能在自由空间独立地存在。SketchofnearfielddetectionRep.Prog.Phys.57(1994)989-1028.PrintedintheUK应用①高分辨率成像（空间分辨率优于100nm）特殊条件下可达到1-5nm②同时收集样品表面的形貌像和光学图像③近场荧光与高分辨超快时间分辨光谱，压微米尺度近场局域光谱④纳米材料，加工，光存储⑤原子操纵原子操纵测量PC-MC的基模电场分布