微量热技术

微量热技术微量热技术评价生物药物稳定性的最基本的分析工具评价生物药物稳定性的最基本的分析工具前言篇前言篇为什么药物的稳定性研究如此之重要？稳定性研究贯穿药物研发过程的始终我们知道成功的新药物的开发直至最后的商品化面市，需要满足三大要素：有效性、安全性和工艺可行性。而这三工艺、生产质量的稳定性结构稳定性-生物活性稳定性的基石大要素均是以药物的稳定性为基础。例如在重组蛋白生产中遇到的挑战：蛋白质表达的稳定性、下游纯化中的稳定性、不同剂型中的稳定性都是影响一些重要蛋白质(例如膜蛋白和多功能结构域蛋白)在成为成功商业化产品中的核心问题。图1图2由上图关于生物药物研发及生产流程的全过程，无一不闪现出稳定性研究的身影。为什么生物药物的稳定性研究更是凸显如此之迫切？我们知道芸芸众生中，任何分子的运动都热运动，分子的稳定性首先取决于其热稳定性。正是源于生物大分子的脆弱的热稳定性，才导致生物药物稳定性研究凸显如此之迫切的根本原因。举例来讲：具有生物活性的蛋白质分子体系是具有独特结构的折叠态，这种活性的折叠态与丧失活性功能的去折叠态的能量差异，只有区区20千焦\摩尔，只是略高于一个氢键的能量，这是一个多么微小的差异。因此我们都有这样的感受和经验：稍微改变的PH值或温度、离子强度就可将具有活性的蛋白质转变成没有生物活性的变性态。但是对于任何一个生物药物的工艺过程，无论是纯化，还是剂型研究以及最终的质量控制，又有哪个不与这些条件的改变发关系呢？(见下图)纯化工艺剂型工艺1当前的形势由目前的形势来讲，有如下三点值得引起我们的密切关注：其一：源于国外的专利保护，我国需立足于自主研发新的生物药物，需占领产业链的高端其二：保证药效、安全性的成功剂型设计是目前我国拥有自主知识产权的新生物药物获得FDA许可的关键技术。其三：对于稳定性研究的测试手段的要求急为迫切：简单、快速、灵敏。为什么微量热技术,特别是其中的DSC成为药物稳定性研究的最基本分析工具？•热稳定性与生物活性稳定性、结构稳定性的直接相关性。•最符合对稳定性研究分析手段的要求：量小、灵敏、快速。•测试对象的通用性：原位溶液样品，无需特别处理；无分子量限制、无光学透明度要求。•成熟技术-近半个世纪的历史，接近万篇的应用文献。它参与了近30年来在生命科学研究、生物制药等方面的所有重大研究发现及进展，这是因为DSC技术是研究热稳定性的最直接、最通用的技术，它具有如下优势：原理篇原理篇微量热技术的原理DSC仪器原理介绍微量量热技术是指在稳定、隔绝的体系下，在程序控制控制温度的条件下，测量样品(特别是液体样品)随温度或时间变化所吸收或放出的全部热量。该技术测量的热量是特指用一般常规普通的量热技术无法测得的微弱热量变化，一般至少在微瓦和钠瓦的级别，可见该技术对量热的灵敏度提出了很高的要求，因此该技术命名为微量热技术。该技术为一通用技术，适用面比较广，在生物、食品、化学、材料等领域均具有广泛的应用前景。特别适用于与生物大分子相关的微弱的、缓慢的热效应的测量，从而确定其稳定性、相态变化、反应性及生物活性。该技术主要包括两种核心技术，一种是测量单个样品随程序温度变化(或时间变化)而进行的量热称为微量热差示扫描技术(即DSC)；另一种是在恒定温度条件下测量随时间变化的两个样品发生相互作用时的实时热量变化，我们称之为等温滴定量热技术(即ITC)。差示扫描量热仪DSC是一项用于生物分子稳定性研究的分析技术，能获得可靠的追踪记录。该技术测定是在对生物分子外加热变性基础上进行的，被广泛用于天然，修饰和突变异构体生物分子之间的比较，缓冲液条件的优化以及包括亲和力定量检测在内的分子间相互作用鉴定。目前，已有成千上百的发表刊物中记录了蛋白质，核酸和脂质分子稳定性的DSC表征的结果。图32IncreasesinthermalstabilityobservedbyTmshifting在一个密闭、隔绝的恒温体系中，同时对其两个完全一致的两个测量池进行完全一致的程序温度控制(线性升温、降温、恒温)，在温度控制过程中，始终保持样品池与参比池间的温度差为零。如上结构示意图所示样品被放置在左侧的样品池，而匹配的缓冲溶液则放置在参照池。以恒定的升温速率温度从低到高进行扫描。以蛋白质分子样品为例，随着蛋白质样品的折叠态的展开，蛋白质样品吸收热量，而消除样品池温差所需的补充能量则通过设备记录下来。这些记录在热谱图上形成一个峰形，其中50%蛋白质样品发生去折叠时所对应的峰顶温度作为熔融温度被记录下来Tm。还可通过对曲线下面积积分可获得去折叠焓变△H以及△Cp等热力学信息。而谱峰的形状则为我们判断去折叠的机理过程提供了依据：是简单的两态过程？还是存在中间态？还是多个结构功能域的协同作用？......总之，DSC不仅可以通过Tm对生物分子稳定性进行定性评价，同时还可对稳定性进行定量化分析，同时还可对蛋白质分子的去折叠的驱动力和机理进行解析。等温滴定量热技术(ITC)ITC和差示扫描量热技术DSC的原理相似，只是增加了滴定模块的应用。它类似于普通化学反应中的酸碱滴定。是指将一种反应物滴定到另一种反应物中，观察他们的反应。由于每次滴定后，反应会放出或吸收一定热量，ITC可捕捉到这种热量的变化，并通过得到的结合反应相关的能量过程的定量特征，直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数，如：结合常数(Ka)、结合位点数(n)，结合焓(△H)、恒压热容(△Cp)和动力学数据(如酶促反应的Km和Kcat).图4原理篇原理篇应用示例我们注意到在中国药典2010版中，在第二部关于化学药品、抗生素、生化药品、药用辅料的检定方法中，已经在其附录中已提及采用热分析技术，其中包括差示扫描量热方法来进行检定和应用。在此，我们需要补充说明的是，该差示扫描量热技术是普通、常规的量热技术，在量热技术中测量不到的微弱、缓慢的热量变化就需要采用高灵敏度的微量热差示扫描量热技术来进行检定和表征。特别是近年来对于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类等生化药品，就愈来愈需要借助于微量热差示扫描技术(DSC)的介入和表征。而且对于液体制剂的研究，微量热技术(特别是微量热DSC技术)的优势表现更为突出。对于中国药典2010版第三部中关于生物制品的检定方法中，微量热技术凭借其技术优势应该可以在生物制品(疫苗、重组DNA、血液制品等(中的发现、检定以及制剂开发研究中，扮演着越来越重要的角色。下面将通过应用示例来说明。3蛋白质工程中选择最稳定结构候选物的检定当前，以抗体、类抗体蛋白以及其他生物制药为代表的新一代药物，正以迅猛的速度大规模进入各种人类疾病的临床试验。以药物产品的制造和配方标准来看，这些潜在的治疗药物的稳定性是至关重要的一项内容。DSC能够快速、准确、简便的测量基因工程蛋白质的热转换中值Tm(相变温度)，作为和蛋白稳定性有关的极其重要的相关指标。在比较不同生物工艺开发的产品，DSC就可以筛选出具有稳定结构的基因工程候选药物，并区分最终可能导致失败的候选者。(见图5)根据热量的变换，DSC可以快速简便的鉴定出最具稳定结构的基因工程蛋白。热稳定性的增高和蛋白表达水平的提高、蛋白功能片断数量的增加均是紧密相关的。(数据和图像引用自StephenDemarest,Biogen-Idec)图5生物制药液体制剂的稳定性研究对于生物制药企业而言，快速找到正确的液体制剂是极为重要的。传统溶液长期稳定性研究的实验涉及将不同浓度的蛋白质储存在各种缓冲液体系中(包含或不含赋形剂)，并施加一系列压力、温度以及光照条件。目前，相关监管机构正积极提倡使用稳定性指示分析法(stabilityindicatingassays)评估生物制剂的稳定性和保质期。由于使用DSC方法预测稳定性的结果和长期稳定性研究的结果相比，两者显示出良好图6筛选最稳定制剂的条件4的一致性。因此，微量热技术已经成为快速筛选溶液环境中蛋白质稳定性的首选工具。DSC通过简便、快速、精确的测定蛋白样品在不同液体制剂条件中的热转换中值Tm(相变温度)作为判别蛋白稳定性的相关指标。应用稳定性指示分析法可以在进入下游工艺开发之前就筛选出具有价值的候选制剂，加速后续的稳定性研究，更可以节约大量的时间和经费投入。鉴定、探索和表征当候选疫苗的合适抗原的鉴定取决于阐明病原和宿主免疫系统之间结构和功能相互作用的研究。等温滴定量热法(ITC)方法，通过提供关于病毒表面抗原表位与其诱发的抗体之间结合的准确的、精确的和丰富的特征数据促进疫苗研究和设计的发展。加快疫苗制剂的开发蛋白质-赋形剂间的相互作用的分析在加工和制剂过程中，保留生物分子的稳定性和活性对于以蛋白质为基础的疫苗至关重要。制剂开发更为重要的一个方面是在最佳浓度下选择赋形剂以提供更长的保质期，同时维持安全性。等温线滴定量热法(ITC)和差示扫描量热法(DSC)提供了下列能力：•确定在制剂开发中基于蛋白质的疫苗的稳定化条件。•了解蛋白质-赋型剂相互作用的机制。容易进行的稳定性指示检测法通过利用DSC和ITC，GlaxoSmithKlineR&D(6)揭示蛋白质结构完整性在有抗菌剂-酚存在时pH最好维持在5.7。在这个pH下，蛋白质的三级结构保持完整(图8)。作为一种蛋白质稳定性指示检测法，DSC与其他常规使用的技术相比有利于在研发早期预测较好的制剂。通过快速筛选各种制剂缓冲液，DSC在预制剂研发中能够节约大量的成本和时间。图8.在含有0.005%(v/v)酚pH5.7(黑色)和含有0%酚pH5.7(红色)、4.5(蓝色)和3.5(绿色)的制剂缓冲液中1mg/mlProX的热容量vs温度(由DSC测定)图。更高的过渡中点(Tm)表示一种更稳定的蛋白质，表明0.005%(v/v)酚pH5.7是更好的选择。感谢GlaxoSmithKlineR&D(PA,USA)友情提供。微量热法正越来越多地被应用于在生物治疗药物和基于蛋白质的疫苗制剂的设计和优化中探索蛋白质-赋形剂间的相互作用。GlaxoSmithKlineR&D应用ITC揭示聚山梨醇-80(一种普遍用于稳定蛋白质的表面活性剂)被表层吸附并与ProX聚集。ITC提供关于结合亲合力常数、结合焓和每个ProX结合位点数。根据等温滴定曲线，得出的结论是聚山梨醇-80结合位点在每个分子的表面活性剂摩尔比大约为10时饱和(图9)。5图7采用DSC技术预估长期稳定性(DSC与HPLC的数据比较，DSC数据与SEC数据的比较）ITC在抗体性质研究以及质量控制中的应用抗体和抗体产品在很多商业化产品中扮演了重要角色，如生物医药、诊断试剂盒以及色谱介质等。这些产品的质量控制对生物医药企业以及诊断试剂公司来说是至关重要的。通常用于检测抗体产品质量的方法有电泳和色谱法，它们能提供结构信息但不能提供结合活性的信息。例如无法给出不同批次间抗体产品活力的差别。等温滴定微量热技术(ITC)提供了一种非常简单而且准确的方法用于抗体的质量控制以及抗体和抗体产品的性质分析。ITC可以快速有效地测定多种参数，例如抗体亲和力(Ka)、抗原结合热(ΔH)以及抗原抗体的结合比(n)。抗体结构上的改变(例如片段化、部分变性以及偶联修饰)都会影响抗体的结合性能。另外，结合热可以用来指示抗原抗体在体内和体外的相互作用。1.确定活性抗体浓度。2.抗体活性的质量控制。3.偶联对抗体活力及亲和力的影响图10活性抗体的定量表征产品篇产品篇产品介绍-Microcal品牌介绍Microcal成立于1977年，位于美国的马塞诸塞州波士顿附近的Northampton,具有近40年专业研发、生产、制造超灵敏度微量热仪的经验和深厚的技术储备，其微量热仪的主要目标客户和涉及的领域就是生命科学，它参与了近40年来在生命科学研究、生物制药等方面的所有重大研究发现及进展，其在生命科学领域的市场份额接近90%，是绝对的市场领导者和技术领先者。到目前为止，以微量热仪为主要研究手段所发表的研究文章就已一万篇，其中一半以上采用了其ITC产品。在研究工作中提及微量热技术的文章更是不胜枚举。Microcal在2008年正是成为GE医疗集团生命科学部的一份子，借