大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

，祁志荣1，张琴1，林媛1，李明远1，张林2，蒋忠华1，李虹1△1.四川大学基础医学与法医学院微生物学教研室，成都（610041）2.华西医院生物治疗国家重点实验室，成都（610041）E-mail：[e-mail]摘要：目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体，并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段，通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因，再通过适当的酶切及连接反应，构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL。重组质粒经限制性性内切酶，PCR及DNA序列测定证实构建成功后，用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞，然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH3T3细胞的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实，rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)，免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH3T3细胞表达。结论rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH3T3细胞中表达，为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础。关键词：rIP-10PE38KDEL，重组免疫毒素，NIH3T3细胞，真核表达中图分类号：R392.11文献标示码：A干扰素诱导蛋白10(IFN-γ-inducibleprotein,IP-10)是CXC家族的一个趋化因子，又名CXC趋化因子配体10(CXCL10)。最早是由Luster等[1]通过用IFN-γ刺激U937细胞株后使用杂交的方法从cDNA基因文库中筛选到的。IP-10的特异性受体CXCR3高表达于活化的T细胞(尤其是Th1细胞)，从而使其成为有关免疫性疾病的重要靶位[2]。本研究正是以大鼠IP-10（rIP-10）作为导向分子，以铜绿假单胞菌外毒素（pseudomonasexotoxinA,PE）的活性片段PE38KDEL作为细胞毒分子，构建一种新的重组免疫毒素真核表达载体。该载体应具有更高的靶向性，降低免疫毒素对机体的毒副作用，有望用于以Th1细胞为主的自身免疫病的治疗，如多发性硬化(MS)等。1材料和方法1.1材料引物由invitrogen公司合成；TaqDNA聚合酶、DL2000Marker、各种限制性内切酶和T4DNA连接酶均购自Takara公司；1kbPlusDNAmarker购自Promega公司;兔抗PE的多克隆抗体购自Sigma公司；TRITC标记的羊抗兔的IgG抗体、封闭用羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒均购自Omega公司；DMEM培养基购自GibcoBRL公司；新生小牛血清购自成都哈里公司；转染试剂盒PolyfectTransfectionReagent购自Qiagen公司；内含PE38KDEL基因片段的质粒PRKL459K-IL-4-PE38KDEL由美国Wisconsin大学SJ.Knechtle教授惠赠；内含rIP-10基因片段的质粒PET-32a(+)-rIP-10由本课题组构建[3]；NIH3T3细胞为四川大学细胞生物学教研室惠赠；真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)和大肠杆菌JM109菌株为本室保存。1本课题得到国家863高科技计划（2002AA214101）和国家自然科学基金（30470613）的资助。(+)-rIP-10的序列设计引物，为了便于克隆和表达，在引物两端分别加入了KpnI和HindIII的酶切位点和相应的保护碱基。上游引物P1：5’-CGGGGTACCATGAACCCAAGTGCTGCTGTCGTT-3’（5’端设有KpnI酶切位点加保护碱基）；下游引物P2：5’-CCCAAGCTTGCGGAGCTCTTTTAGACCTTCTTTG–3’（5’端设有HindIII酶切位点加保护碱基，不含终止密码子TAA）。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共扩增35个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1g/L的琼脂糖电泳分析。1.2.2重组载体的构建（1）PE38KDEL基因的获得：用HindIII和EcoRI双酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDEL，经1g/L琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收酶切的小片段PE38KDEL。（2）rIP-10基因的PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，用KpnI和HindIII双酶切。（3）真核表达载体pcDNA3.1(+)用KpnI和EcoRI双酶切,经1g/L琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收酶切的大片段。（4）胶回收的载体pcDNA3.1(+)与两个目的基因片段（rIP-10与PE38KDEL）按质粒:插入片段(分子摩尔数)=1:3-10的连接反应原则，在T4连接酶作用下16℃连接反应过夜，转化感受态大肠杆菌JM109，挑取单克隆菌落扩增培养，提取pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL质粒以备作鉴定。质粒提取、胶回收和连接反应等均按照试剂盒操作流程进行。1.2.3重组载体的鉴定及序列分析将具有Amp抗性的阳性克隆经扩增提取质粒后，分别用PCR扩增、限制性内切酶（KpnI、HindIII和EcoRI）酶切鉴定，并对两种鉴定均与预期结果相符的克隆进行DNA序列测定（由invitrogen公司完成）。1.2.4重组载体转染NIH3T3细胞NIH3T3细胞常规培养于含10%小牛血清的DMEM中，于转染前一天收集细胞并接种于铺有盖玻片的六孔板中，细胞浓度约为3×105个/孔。在37℃，50ml/LCO2条件下培养24h，使每孔中细胞汇合达60%左右。按PolyfectTransfectionReagent说明书进行转染，操作如下：将重组质粒1.5µg溶于100µl不含血清及抗生素的DMEM培养基中，然后加入10µlPolyfect，旋涡混匀。20~25℃静置5~10min后，加入0.6ml含血清及抗生素DMEM培养基。吸出六孔板孔中的培养液，加入1.5ml含血清及抗生素新鲜DMEM培养基，然后迅速加入转染复合物，轻轻摇匀，37℃，50ml/LCO2培养箱培养48h后检测目的基因的表达。转染设两个复孔，同时另设两组对照：一组为空载体转染对照，一组为空白对照。1.2.5免疫荧光法鉴定瞬时表达将上述转染细胞培养48h后，用PBS冲洗3次，每次5分钟。40g/L多聚甲醛固定15min，PBS冲洗3次，每次5分钟。室温下用正常羊血清封闭30min，滴加1:200稀释的兔抗PE38的一抗30µl，4℃过夜。第二天用PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加1:200稀释的TRITC荧光标记羊抗兔的IgG抗体30µl，37℃孵育30min。以上操作皆在六孔板中进行。将六孔板内细胞爬片取出，置于装有PBS的平皿中彻底冲洗3次，每次5分钟，以500ml/L甘油封片，置荧光显微镜下检测。2结果2.1真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL的构建用设计的rIP-10特异性引物对PET-32a(+)-rIP-10质粒进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳显示片段大小为270bp左右，与rIP-10片段大小相符（见图1），送公司测序，结果显示rIP-10序列完全正确。用设计好的内切酶对真核表达载体pcDNA3.1(+)、rIP-10片段、PE38KDEL片段分别两两双酶切后，胶回收相应片段，再在T4连接酶的作用下行连接反应，通过Amp抗性筛选最后获得pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL重组质粒（见图2）图1rIP-10基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig1PCRproductofrIP-10genebyagarosegeleletropheresis1:Negativecontrol;2:Positivecontrol;3:rIP-10PCRproduct;4:DL2000marker图2重组质粒pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL结构图谱Fig2MapoftherecombinantplasmidpcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL2.2重组质粒的酶切鉴定及序列分析用限制性核酸内切酶KpnI、HindIII和EcoRI对重组质粒两两双酶切（见图3），电泳显示条带分别为270bp、1050bp与1350bp左右，与rIP-10，PE38KDEL和rIP10-PE38KDEL的基因片段大小相符，而重组质粒和空质粒大小也均与预期结果相符。送公司测序后，结果表明rIP-10-PE38KDEL重组质粒序列完全正确。间接免疫荧光法鉴定瞬时转染结果转染细胞培养48h,进行免疫荧光染色。在倒置荧光显微镜下可观察到重组质粒转染组多数细胞有较强的红色荧光,呈全细胞分布,计数48小时转染率达80%，而两种阴性对照：空质粒转染组和未转染组，均未见荧光(图4)。图4重组质粒在NIH3T3中的表达(×200)Fig4TheexpressionofrecombinantplasmidinNIH3T3cells(×200)1.NIH3T3cellstransfectedwithrecombinantplasmidpcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDELunderimmunofluorescencemicroscope(A)andphasecontrastmicroscope(D);2.NIH3T3cellstransfectedwithemptyvectorpcDNA3.1(+)underimmunofluorescencemicroscope(B)andphasecontrastmicroscope(E);3.NIH3T3cellswithouttransfectionunderimmunofluorescencemicroscope(C)andphasecontrastmicroscope(F).3讨论免疫毒素(Immunotoxins,ITs)是指将具有细胞毒性的分子（毒素）和具有导向能力的分子（载体）偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。这种分子是通过抑制细胞蛋白质合成和诱导细胞凋亡而达到杀伤靶细胞的作用，目前应用于抗肿瘤、抗移植排斥反应和治疗自身免疫性疾病等领域。免疫毒素的细胞毒性成分主要选择铜绿假单胞菌外毒素（pseudomonasexotoxinA,PE）或白喉毒素（Diphtheriatoxin,DT）的活性片段，由于PE类重组免疫毒素具有高效、特异性地杀伤特定的靶细胞，而且体内没有预