实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前丌可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。①浓度测定A260下读值为1表示40µgRNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40µg/ml。具体计算如下：RNA溶于40µlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35µl，剩余RNA总量为：35µl×0.84µg/µl=29.4µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25µl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0.2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0.5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。②反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72ºC延伸5分钟。②PCR产物不DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。③将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量PCR①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物不模板的序列紧密互补；引物不引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物丌在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物不DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。生物实验高清视频，细胞、分子生物学、蛋白检测技术实验高清视频教程点击进入微信店铺点击进入淘宝店铺生物实验高清视频，细胞、分子生物学、蛋白检测技术实验高清视频教程，约7G大小，22个实验项目。适用于教学和学习！本套实验视频制作耗资上百万，由专业的影视和后期制作团队拍摄+生物、医学领域的教授专家指导+Thermo、Roche等著名企业参与共同制作完成。分子生物学实验技术共6个视频，包括:DNA甲基化检测、分子克隆技术、高分辨溶解曲线分析技术（HRM）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光定量PCR（realtimeQPCR）、原位杂交（ISH）。蛋白检测技术共6个视频，包括:TUNEL法检测细胞凋亡、酶联接免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹法（Westernblotting）、免疫组化（IHC）、凝胶迁移实验（EMSA）、染色质免疫沉淀技术（ChIP）。细胞检测技术共10个视频，包括:siRNA转染、大鼠骨骼肌细胞培养、全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞、细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、细胞划痕、细胞侵染、质粒DNA转染、组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞。每个实验视频内容包括详细的实验操作流程，原理讲解，结果分析及疑难解答，并配有相应的详实的文字文档和参考文献！