PDGFRA基因突变检测试剂盒(测序法)说明书

PDGFRAPDGFRAPDGFRAPDGFRA基因突变检测试剂盒(DNA(DNA(DNA(DNA测序法))))说明书PDGFRAPDGFRAPDGFRAPDGFRARelatedRelatedRelatedRelatedMutationMutationMutationMutationDetectionDetectionDetectionDetectionKitKitKitKit(DNA(DNA(DNA(DNASequencingSequencingSequencingSequencingAnalysis)Analysis)Analysis)Analysis)【产品名称】通用名：PDGFRA基因突变检测试剂盒(测序法)英文名：PDGFRARelatedMutationDetectionKit(DNASequencingAnalysis)【包装规格】24人份⁄盒【预期用途】本试剂盒适用于PDGFRA基因12和18外显子突变的检测，从而辅助胃肠道间质瘤的临床诊断及指导临床用药。【检测原理】本试剂盒采用荧光定量PCR扩增人基因组中PDGFRA基因，并对扩增的片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染。【主要组成成份】产品组成主要成分规格及装量PDGFRA12PCR缓冲液引物、探针、buffer、dNTPs等480µL×1管PDGFRA18PCR缓冲液引物、探针、buffer、dNTPs等480µL×1管Taq酶混合物Taq酶+UNG酶24µL×2管PDGFRA12阳性质控品含PDGFRA12扩增目的基因片段的重组质粒40µL×1管PDGFRA18阳性质控品含PDGFRA18扩增目的基因片段的重组质粒40µL×1管阴性质控品DEPCH2O40µL×2管PDGFRA12测序引物引物48µL×1管PDGFRA18测序引物引物48µL×1管SAP酶混合物CIAP+EOXI48µL×2管测序试剂Bigdye及缓冲液24µL×2管【储存条件及有效期】-20℃避光保存，避免反复冻融，有效期：6个月。【适用仪器】测序仪器：ABI310、ABI3100、ABI3130/ABI3130XL、ABI3730等基因分析仪。【样本要求】本试剂盒适用于人胃肠道间质瘤组织全基因组DNA检测，可选用本公司配套的石蜡提取试剂盒或QIAampDNAFFPETissueKit。【检验方法】1.试剂准备(试剂开管前请完全解冻后充分混匀并短暂离心)配制：按每个反应取PCR反应液20µL、Taq酶混合物1µL计算，乘以所需的反应管数(建议酌情可多配一个反应量)，分装：用微量加样器在每一PCR反应管内加入21µL上述混匀的反应液，存于4℃。注意：最好在DNA提取结束后配制反应液。2.加样：在上述准备的装有混合反应液的PCR反应管中加入标本的DNA4µL。3.PCR反应：在ABI系列及Stratagene系列PCR检测仪设定如下程序：PCRPCRPCRPCR荧光定量仪器型号保温45454545循环保温ABI系列以及Mx3000P等Stratagene系列37℃2分钟94℃4分钟①94℃15秒②60℃45秒25℃恒温ABI系列在PCR循环第二步60℃是收集荧光信号。4、反应完毕，存储结果以便进行数据处理。5、PCR产物的酶解对PDGFRADNA含量CT≤30的PCR产物取5µL，再加入2µLSAP酶混合物震荡混匀，瞬时离心，37℃60分钟，80℃15分钟。6、测序PCR反应选取阳性PCR酶解产物3µL、测序试剂1µL和测序引物2µL进行PCR扩增，具体条件：变性25循环恒温96℃1分钟①96℃10秒②50℃5秒③60℃4分钟4℃7、测序产物纯化96孔板整板离心方法：(1)在每孔内加入16µL醋酸钠-乙醇混合物(3MNaAc:无水乙醇=1：15)，剧烈震荡，避光静置15分钟3500g以上4℃离心半小时。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心。(2)加入70µL70%预冷乙醇，剧烈震荡，3500g以上4℃离心15分钟。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心。(3)加入70µL70%乙醇，温和颠倒数次混匀(不要剧烈震荡)，3500g以上4℃离心5分钟。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心。(4)让酒精在室温挥发干净，加入10µLHi-DiFormamide溶解DNA。(5)在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。上机电泳。单个0.2ml离心管离心方法：(1)在每孔内加入16µL醋酸钠-乙醇混合物(3MNaAc:无水乙醇=1：15)，剧烈震荡，避光静置15分钟12000g以上4℃离心半小时，吸弃上层液体。(2)加入70µL70%预冷乙醇，剧烈震荡，12000g以上4℃离心15分钟，吸弃上层液体。(3)加入70µL70%乙醇，温和颠倒数次混匀(不要剧烈震荡)，12000g以上4℃离心5分钟。吸弃上层液体。(4)让酒精在室温挥发干净，加入10µLHi-DiFormamide溶解DNA。(5)在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。上机电泳。在自动化的基因分析仪上进行测序。若不能当日测序，可置-20℃保存。【检测结果分析】ExonExonExonExon12121212号外显子突变分析运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域(注意：此步骤决不能省略)在Edit菜单下点击“Reverse+Complement”，按Find快捷键，找到序列“TATGAAATT”、移动光标至“T”左侧的一个碱基上，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“DeleteCutoffSequences”删除以上区域；按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，对比Exon12外显子正常的序列，确定突变的位置。(2)将其后面的序列与下面野生型序列对比，标记处可能发生561位点Val(V)突变Asp(D)。核苷酸(野生型)TATGAAATTCGCTGGAGGGTCATTGAATCAATCAGCCCA氨基酸(野生型)YEIRWRVIESISP核苷酸(突变型)TATGAAATTCGCTGGAGGGACATTGAATCAATCAGCCCA氨基酸(突变型)YEIRWRDIESISPExonExonExonExon18181818号外显子突变分析运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域(注意：此步骤决不能省略)按Find快捷键，找到序列“GACTTTGGC”、移动光标至“G”左侧的一个碱基上，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“DeleteCutoffSequences”删除以上区域；按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，对比Exon18外显子正常的序列，确定突变的位置。(2)将其后面的序列与下面野生型序列对比，标记处可能发生842位点Asp(D)突变Val(V)。核苷酸(野生型)GACTTTGGCCTGGCCAGAGACATCATGCATGATTCGAAC氨基酸(野生型)DFGLARDIMHDSN核苷酸(突变型)GACTTTGGCCTGGCCAGAGTCATCATGCATGATTCGAAC氨基酸(突变型)DFGLARVIMHDSN【生产企业】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司【生产地址】北京经济技术开发区康定街1号国盛科技工业园14号楼二层【电话】010-67810661【传真】010-67810662【邮编】100176【医疗器械生产企业许可证编号】京药监械生产许20090031【说明书批准及修改日期】2011年8月第一版