第二章--天然产物化学成分提取分离方法

第二章天然产物化学成分的提取分离与结构鉴定本章内容天然产物化学成分的提取天然产物化学成分的分离与纯化天然产物化学成分的结构鉴定与测定2-1天然产物化学成分的提取1、天然产物化学成分的构成特点•同种植物含有多种结构类型的化学成分•总成分含量少、种类多•有效成分含量低概述2、提取分离前的文献调研一、天然产物化学成分的预试验与系统提取（一）天然产物化学成分的预试验初步了解所含成分情况，然后再进行有计划、有针对性的提取分离。1.系统预试验——根据各成分极性的不同，选择不同极性的溶剂，将天然产物化学成分系统的分成几个不同的部分，然后再利用显色反应或沉淀反应或结合纸色谱、薄层色谱定性判断各部分中可能含有的化合物成分类型。2.单项预试验——生物碱：在酸性条件下与碘化铋钾显棕黄色或橘红色沉淀。黄酮：黄酮类化合物的乙醇溶液中加入镁粉，滴入浓盐酸后振荡，泡沫显桃红色。皂苷、强心苷、甾体：其乙酐溶液与浓硫酸反应后显示各种颜色皂苷；水溶液振荡时能产生大量泡沫。酚类：与三氯化铁反应显示各种颜色。糖苷类：与斐林试剂反应有砖红色沉淀生成。有机酸：与溴酚蓝反应显黄色。氨基酸、多肽：与茚三酮反应显蓝紫色。蛋白质：双缩脲反应显紫红色。（二）天然产物化学成分的系统提取•1.系统溶剂提取——选择几种不同极性的溶剂，由低极性到高极性进行分步提取，使各成分依其在不同极性溶剂中的溶解度不同而得以分别提取出来。•常用的两种溶剂系统为：•（1）己烷—乙醚—甲醇—水•（2）己烷—二氯甲烷—甲醇—水•2.单一溶剂提取——根据水可提取极性成分，石油醚可提取非极性成分，醇能提取大部分成分的特点，用一种溶剂将性质相近的组分集中在一起提取出来。•3.混合溶剂提取——采用两种或两种以上混合溶剂进行提取，有时会提高提取效率。二、天然产物化学成分的传统提取方法（一）溶剂提取法•提取原理:根据天然产物化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从天然材料中溶解出来。提取依据：被提取化学成分的溶解性（极性）•提取的关键：提取溶剂的选择•溶剂的选择原则：①与所提成分不发生化学反应;②对所提成分溶解度大,对杂质溶解度小;③价廉、易得、无毒、安全、易于回收等。•影响溶剂提取的因素：化学成分的极性:被提取成分的极性是选择溶剂的最重要依据影响化合物极性的因素：(1)化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性；酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷举例：判断下列各组化合物极性大小。OHOCOCH3O提取溶剂的选择(1)溶剂的分类:强极性溶剂——水、酸水、碱水亲水性有机溶剂——甲醇、乙醇、丙酮(可与水任意混溶)亲脂性有机溶剂——乙醚、氯仿、苯、石油醚等(不与水混溶)（2）常用溶剂极性大小：水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞四氯化碳＞正己烷≈石油醚。常用的溶剂提取方法（1）浸渍法（2）渗漉法（3）煎煮法（4）回流提取法（5）连续回流提取法（二）水蒸气蒸馏法•该法适用于具有一定挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水的化学成分的提取分离，例如挥发油、某些小分子生物碱（如麻黄碱、烟碱、槟榔碱）、某些小分子的酚性物质如牡丹酚等酚类、少数挥发性蒽醌苷元、香豆素苷元等，可采用水蒸气蒸馏法提取。（三）升华法天然产物化学成分有少量具有升华性，如茶碱、咖啡因、游离羟基蒽醌类成分、一些小分子香豆素类成分等。（四）分馏法（利用沸点不同）（五）吸附法（氧化铝、氧化镁、活性炭等）（六）沉淀法铅盐法：利用乙酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐。脱铅方法：硫化氢气体（七）盐析法（提取液中加入无机盐）（八）透析法利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大分子物质不能通过的性质达到分离的方法。三、天然产物化学成分的现代提取方法（强化溶剂提取法）（一）超临界流体提取法(supercriticalfluidertraction,SCFE或SFE)：以超临界流体作为提取溶剂的一种提取新技术。超临界流体(supercriticalfluid,SCF):处于临界温度(Tc)、临界压力（Pc）以上、介于气体与液体之间的流体。SCF特点：具有液体和气体的双重特性，萃取效率高；萃取过程几乎不用有机溶剂；萃取流体可循环使用,节约能耗。常用的SCF有：二氧化碳、氨、乙烯、丙烷等•超声波提取就是利用其具有的机械效应、空化效应、热效应及次级效应，通过增大介质分子的运动速度、穿透力以提取天然产物化学成分的方法。（二）超声波强化辅助提取法（1）超声波提取是一物理过程，对天然产物的生物活性无破坏，适宜于热敏性成分的提取。（2）超声波提取过程不需加热，提取时间短，节省能源。（3）超声波提取过程溶剂耗量少，提取效率高。优点：（三）微波辅助提取（microwave-assistedextraction,MAE）法微波提取法是利用微波能来破坏植物细胞的细胞壁和细胞膜，从而达到提取细胞内有效成分的目。(1)微波加热的热效率较高，升温快速而均匀，显著缩短了提取时间，提高了提取效率。(2)选择性高，溶剂耗量少，适宜于热敏性成分的提取。(3)重现性好，适用范围广。(4)设备简单、投资少，操作简单、方便。优点：（四）酶法提取一、根据物质溶解度差别进行分离1、结晶利用温度不同引起溶解度的改变而使有效成分以晶体的形式析出以达到分离物质的目的。2、溶剂沉淀在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。3、调节pH4、盐析沉淀•2-2天然产物的分离和纯化调节溶液的pH值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。通过加入某种沉淀试剂使之生成不溶于水的盐类沉淀析出。二、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离液-液萃取法液-液分配柱色谱法将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂(流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。三、根据物质的吸附性差别进行分离吸附的目的：一是吸附除去杂质（常指鞣质、色素等）；一是吸附所需物质，然后再用适当的方法进行解吸。吸附的类型：物理吸附：也称表面吸附，因构成溶液的分子与吸附剂表面分子的分子间的相互作用所引起的；特点：无选择性，吸附和解吸附过程可逆，可快速进行，故实际工作中用的最多；常见吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭吸附等。化学吸附：如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝的吸附，或生物碱被酸性硅胶的吸附等；特点：具有选择性，吸附牢固，不可逆，故用的较少。半化学吸附：如聚酰胺对黄酮、醌类等化合物之间的氢键吸附，力量较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。活性炭：非极性吸附剂，对非极性物质具有较强的亲和力。硅胶和氧化铝（柱色谱）：极性吸附剂。聚酰胺：氢键吸附，极性物质和非极性物质均可适用，可用于酚类、醌类、黄酮类、鞣质的分离。大孔吸附树脂：一种具有大孔结构的高分子吸附剂，分为非极性与极性两类。性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，所以在中药化学成分的分离中被广泛应用。四、根据物质分子大小进行分离透析法、凝胶过滤法：利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用；超滤法：利用分子大小不同引起的扩散速度的差别。五、根据物质的解离程度不同进行分离酸性、碱性及两性基团的化合物在水溶液中多呈解离状态，可以与离子交换树脂上的基团交换，从而与其它非解离性物质分开，常用的是离子交换法。六、色谱法1、色谱法的基本原理：利用混合物中各组分的物理性质不同而在两相（固定相和流动相）之间的不均匀分配进行分离的一种方法。2、色谱法的分类(1)按流动相类型进行分类：气相色谱、液相色谱(2)按操作形式进行分类：纸色谱(PC)、薄层色谱（TLC）、柱色谱（CC）、毛细管色谱(CTC)等。2-3天然产物化学成分的结构鉴定与测定一、天然产物化学成分结构鉴定的一般程序和方法二、四大谱在天然产物化学结构鉴定方面的应用三、立体结构的测定方法四、一些天然产物结构的光谱特征程序方法纯度检验1.检查有无均匀一致的晶型、颜色2.有无敏锐的熔点3.TLC在三种展开剂中均呈单一点4.GC或HPLC初步推断化合物类型1.观察样品在提取过程中的行为2.测定其相关理化常数3.结合文献调研测定分子式计算不饱和度1.元素定量分析及分子量测定（同位素峰度比法及HR-MS）,确定分子式2.计算不饱和度确定分子中含有的官能团、结构片段或基本结构骨架1.官能团定性分析2.测定并解析化合物的有关谱学数据3.结合文献调研判断并确定分子的构造式1.综合分析有关谱学数据及官能团定性定量分析结果2.与已知化合物进行多方比较推断并确定分子的立体结构（构型、构象）1.测定ORD或CD2.测定NOE或2D-NMR3.进行X-射线衍射分析1.获得样品的背景信息2.根据样品来源和参考文献(原始文献和二手文献)确定化合物类型3.测定样品的物理常数,查阅有关文献手册,初步判断样品是已知物或未知物,若是已知物,则按已知物的程序进行鉴定;若是未知物则按未知物的程序进行结构测定.一、天然产物化学成分的结构鉴定与测定的一般程序和方法（一）已知化合物鉴定的一般程序和方法1.纯度检验2.测样品的物理常数，与已知标准品的文献值对照，比较是否一致或接近。3.测样品与标准品的混熔点。4.将样品与标准品在三种溶剂系统中共色谱(PC或TLC),比较其Rf值是否一致。5.测样品的IR光谱图,与标准品的图谱或与标准谱图进行比较。检查纯度的方法：•外观、颜色、形态是否均一；•测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率等，这些物理常数都能反映化合物的纯度。•如果是已知物，用已知结构的对照品进行对照测定或测定它们的共熔点等；•也可对照文献报导值（注意各种测定条件的一致性）•薄层层析（三种展开系统和三种显色方法）•GC、HPLC等；(二)未知物结构测定的一般程序与方法•1.纯度检验，物理常数测定，与文献值比对。•2.进行检识反应，确定样品类型。•3.进行元素定性、定量分析，测得分子量，确定分子式。•4.测四谱并综合分析四谱数据，推导出化合物的基本结构骨架信息。•5.根据推出的结构，将所测得的四谱，特别是NMR谱的数据进行归属分析验证。←二、四大谱在结构测定中的应用（一）紫外—可见光谱（UV-VIS）原理：分子中电子跃迁引起的吸收，其中n-π*、π-π*的跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现紫外区和可见光区(200~700nm)。200nm400nm700nm紫外区（UV）可见区（VIS）•应用：•（1）推断化合物的骨架类型——共轭体系。•（2）取代基团的位置、种类、数目的推断。•（3）用于定量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）。•特点：•样品用量少（只需5-10μg）•样品能回收测定；•常规紫外光谱仪价格低廉；（二）红外光谱（IR）原理：分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外吸收光谱。40003600300015001000625cm-1特征频率区指纹区特征官能团的鉴别化合物真伪的鉴别羟基（酚羟基、醇羟基）3600~3200cm-1游离羟基~3600cm-1氢键缔合羟基3400~3200cm-1羰基1600~1800cm-1酮~1710cm-1酯1710~1735cm-1芳环1600、1580、1500cm-1有2~3个峰双键1620~1680cm-1两个化合物完全相同的条件1、特征区完全吻合2、指纹区也需完全一致应用：IR对未知结构化合物的鉴定，主要是用于官能团的确认、芳环取代类型的判断等定性分析。特征官能团的鉴别化合物真伪的鉴别IR用于鉴定化合物的方法有两种：(1)与标准物谱图对照法。在相同条件下，若两个谱图完全吻合，则两物质相同；否则不