天然产物化学刘湘版--天然产物的提取与分离

第二章天然产物的提取分离SLNS-快速渗漉提取浓缩机组一、天然产物化学成分的预试验与提取二、天然产物化学成分的提取三、天然产物化学成分的分离与精制四、色谱分离分析法教学目的与要求了解天然产物化学的预实验与提取掌握天然产物化学成分提取分离的原理与方法掌握色谱分离方法预试验定性试验系统分离一、天然产物化学成分的预试验与提取二、天然产物化学成分的提取常用提取方法溶剂法沉淀法膜分离法结晶法升华法分馏法压榨法等溶剂沸点介电常数(20oC)溶解度溶剂/水%水/溶剂%石油醚环己烷30-12080.71.892.02苯乙醚氯仿醋酸乙酯正丁醇803561771182.294.344.816.0217.80.1756.040.8156.077.450.0631.4650.0722.9820.5丙酮乙醇甲醇水56786510020.724.332.680.4任意混合石油醚环己烷苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水1)常用溶剂的性质1溶剂法原理：相似者相溶范围：所有化学成分2)天然产物各类成分的极性与提取溶剂的关系植物成分极性强弱植物成分结构类型适于提取溶剂亲脂性强叶绿素、脂肪油、挥发油石油醚亲脂性较强游离生物碱、苷元、甾类、萜类、某些有机酸乙醚、氯仿中等极性中偏小某些苷类(如强心苷等)氯仿-乙醚(2:1)中等某些苷类(如黄酮苷类)乙酸乙酯中偏大某些苷类(如蒽醌苷、皂苷等)正丁醇亲水性较强极性大的苷、糖类、氨基酸等丙酮、乙醇、甲醇亲水性强蛋白质、粘液汁、糖类、氨基酸、无机盐、苷类水3)选择溶剂注意点(1)对有效成分溶解度大,对杂质溶解度小(2)不与化学成分起化学变化(3)经济、易得、使用安全4)常见溶剂提取工艺浸渍法渗滤法煎煮法热回流提取法影响提取效率的因素1)原料粉碎度2)提取时间3)提取温度4)设备条件•浸渍法：浸渍法系将天然产物粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。•渗漉法：渗漉法是将天然产物粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。SLNS-快速渗漉提取浓缩机组用溶剂提取植物有效成份时，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法和连续回流提取法等。煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时后放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取天然产物有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。提取方法溶剂操作提取效率使用范围备注浸渍法水或有机溶剂不加热效率低各类成分，尤遇热不稳定成分出膏率低，易发霉，需加防腐剂渗漉法有机溶剂不加热—脂溶性成分消耗溶剂量大，费时长煎煮法水直火加热—水溶性成分易挥发、热不稳定不宜用回流提取法有机溶剂水浴加热—脂溶性成分热不稳定不宜用，溶剂量大连续回流提取法有机溶剂水浴加热节省溶剂、效率最高亲脂性较强成分用索氏提取器，时间长CO2超临界流体提取法特点超临界流体密度＝液体超临界流体粘度＝气体优点1、萃取能力强，大大提高效率2、温度低，热敏性、易氧化分解的物质不易破坏3、时间短，2~4小时可完成4、提取物无溶剂残留物，安全性5、提取物质量稳定，标准易控制具有更低的粘度和更高的扩散速度，使其适合于对植物成分的提取2沉淀法1)专属试剂沉淀法生物碱类雷氏铵盐甾体皂苷、三萜皂苷胆甾醇甾体皂苷2)分级沉淀法水/醇法（除去糖、蛋白质等水溶性杂质）DNA醇/水法（除去树脂、叶绿素水不溶性杂质）醇/醚法（沉淀皂苷成分与脂溶性杂质分离）利用有机物的溶解性或与某些试剂产生沉淀的性质。可逆。3）铅盐沉淀法•是利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐或铅络合物沉淀，而使各成分得以分离的方法。•铅盐沉淀法既可用来除去杂质，也可用来沉淀有效成分。脱铅方法•通入硫化氢气体法•硫酸盐或磷酸盐•阳离子交换树脂法4）盐析法•此法是向混合物水溶液中加入易溶于水的无机盐至一定浓度或成饱和状态，使某些中药成分在水中溶解度降低而析出，达到与其他杂质分离的目的。常用于盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。•如：三颗针根粉———小檗碱盐酸盐•滇三七粉———三七皂苷乙3膜分离法利用小分子物质在溶液中可通过具有一定孔径的膜，而大分子物质不能通过的性质可达到分离的目的。常用于蛋白质、多肽、多糖等大分子化合物与无机盐、单糖、双糖等小分子化合物的分离。膜过滤的基本概念微滤MF超滤UF反渗透RO膜过滤反渗透与超滤的区别：反渗透分离的物质是无机盐类小分子，渗透压较高，为了使溶剂透过薄膜，其操作压力要大，采用压差1~10Mpa；而超滤则是从小分子溶质或溶剂分子中分离出较大的溶质分子（如有机胶体、蛋白质、多糖），由于高分子溶质的存在,渗透压较低，采用较低的压力即可过滤,采用100~1000kpa。均为压力驱动型膜分离过程纳滤NF反渗透的工作原理：淡水海水淡水淡水海水海水压力＞渗透压渗透压半透膜半透膜半透膜a）、渗透b）、渗透平衡c）、反渗透1)、渗透：淡水穿过半透膜进入含盐海水。2）、渗透平衡：在渗透过程中，淡水穿过半透膜进入海水后，会呈现出一种流体静压差，在此压差下，物质静传递量为零，两侧达成平衡。3）、反渗透：若在海水一侧加压，水又会通过半透膜进行逆向流动。p超滤的工作原理：在外压p作用下，当含有高、低分子化合物溶质的溶液通过膜表面时，溶剂和小分子（水、无机盐类）将通过薄膜，作为透过物被收集。膜另一侧的高分子溶液（如有机胶体）被薄膜截留作为浓溶液被收集起来。影响结晶的因素：结晶溶剂的选择（1）对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差别；“热时溶解，冷却即析出”。对于杂质，不溶或难溶。（2）与被结晶成分不发生化学反应。(3)溶剂的沸点适中，若沸点过高，则附着于晶体表面不易除去，过低又不利于晶体析出。4结晶法提取或分离物↓溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤溶液↓放置（冷藏）析晶，过滤粗结晶↓重复上述操作（重结晶）结晶P32结晶纯度的判断•1)晶形和色泽•结晶性纯净物质，一般具有一定的晶形和均匀的色泽。化合物结晶的形状往往因所用溶剂不同而有差异。•2)熔点和熔距•单体化合物还应有一定的熔点和较小的熔距。如为纯净的化合物，重结晶前后的熔点应该一致。p34•3)色谱分析法•晶体纯度的进一步确认，须采用色谱法，常用的有薄层色谱和纸色谱等。•若某成分经同一溶剂数次结晶，其晶形一致，色泽均匀，熔点一定且熔距较小，同时在薄层色谱或纸色谱上，经数种不同展开剂系统鉴定，均得到一个斑点，一般可认为是一个单体化合物。５升华法固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。天然产物中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自天然产物中提取出来。例如樟木中升华的樟脑（camphor），在《本草纲目》中已有详细的记载，为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。茶叶中的咖啡碱在178℃以上就能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类，有机酸类成分，有些也具有升华的性质。６分馏法利用提取成分具有不同沸点的性质而进行分离。毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱石榴皮中的伪石榴皮碱、异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱三、天然产物化学成分的分离与精制(一)根据物质溶解度差别进行分离1.原理:相似者相溶2.方法:1)重结晶法利用温度差异对样品溶解度的不同达到分离2)混合溶剂法H2O-EtOH、EtOH–H2O、EtOH-Et2O粗组份少量易溶样品溶剂样品溶液滴加难溶样品溶剂放置结晶3)pH调整法H+/OH-或OH-/H+4)沉淀法样品酸水液无机酸盐H2OH2S有机酸盐重金属硫化物有机酸有机溶剂萃取OH-有机溶剂萃取生物碱(二)根据物质分配系数的不同进行分离1.原理:利用物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不同达到分离2)分离因子（b值）与分离难易的关系K=CU/CLb=KA/KBK值与萃取次数成反比，即K值越大萃取次数越少，反之越多b值越大，越易分离；b1时，无法分离1)分配系数（K值）与萃取次数的关系B.Ka与pKa表示酸碱性化合物酸碱性强弱,而pH值变化则可改变化合的存在状态。HA+H2OA-+H3O+游离型游离型B+H2OBH++OH-酸性物质碱性物质3)酸碱度（pH值）对分配比的影响A.游离型与解离型物质因素KapKapH3pH12亲脂溶剂亲水溶剂酸性物质越大越小游离型解离型游离型化合物分配比大解离型化合物分配比大碱性物质越小越大解离型游离型(三)根据物质吸附能力差异进行分离1.吸附层析的种类2.物理吸附1）基本规律：“相似者易于吸附”2）基本特点：无选择性、可逆吸附、快速3）基本原理：吸附与解吸附的往复循环4）三要素—吸附剂、溶质(被分离物)、溶剂物理吸附化学吸附半化学吸附固—液吸附吸附再吸附解吸再解吸直至分离吸附剂溶质溶剂强弱强强中弱弱中中极性吸附剂吸附剂的吸附力一定时，溶质极性越强，洗脱剂的极性也应越强。非极性吸附剂吸附剂的吸附力一定时，溶质极性越强，洗脱剂的极性越弱。5）极性强弱的判断(与功能基的种类、数目多少和排列方式有关)(1)亲水性基团与极性成正比，亲脂性基团与极性成反比；(2)游离型化合物极性弱、具亲脂性，解离型化合物极性强、具亲水性；6）溶剂的极性—依据介电常数来决定3.化学吸附1）基本特点：有选择性、不可逆吸附2）基本原理：产生化学反应(1)酸性物质与Al2O3发生化学反应(2)碱性物质与硅胶发生化学反应(3)Al2O3容易发生结构的异构化3）应尽量避免4.半化学吸附1）基本特点：介于物理吸附和化学吸附之间2）基本原理：以氢键的形式产生吸附硅胶氧化铝：极性吸附活性炭：非极性吸附聚酰胺：氢键吸附硅胶硅胶的化学组成是：SiO2.xH2O具有多孔性的硅氧环及－Si－O－Si－的交链结构，其骨架表面的硅醇基团能过氢键与极性或不饱和的分子相互作用吸附性能取决于硅醇基的数目和含水量改良吸附剂制备提高分离效果普遍采用优点多键合相硅胶：硅醇基与正辛醇、聚乙二醇等在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相－Si－O－Ｃ－;(十八烷基三氯硅烷)－Si－O－Si－Ｃ－;（有机胺）－Si－O－Si≡N对化合物的分离具有不同的选择性，用于HPLC优点：可反复使用样品破坏小不可逆吸附少低洗脱体积凝胶抽提DNA片断example含硅胶膜组件，在高盐缓冲液中结合DNA，在低盐缓冲液或水中洗脱下来，去除了引物，核苷,酶,矿物油,盐,琼脂糖,EB和其他来自DNA样品的杂质UNIQ-10柱式DNA胶回收；UNIQ-10柱式PCR产物回收由Al(OH)3直接在高温（约600℃）下脱水制得。微碱性适于分离生物碱不宜用于醛、酮、酯和内酯等类型化合物的分离改良可制得中性氧化铝吸附活性与含水量关系：含水量活性洗脱能力：极性溶剂＞非极性溶剂逐步增加溶剂极性，化合物依极性大小依次分离。氧化铝活性炭用来分离水溶性物质的主要方法之一对苷类、糖类及氨基酸等分离效果较好吸附能力：芳香族化合物＞脂肪族化合物；大分子化合物＞小分子化合物；极性基团多的化合物＞极性基团少的化合物使用前将活性炭120℃加热4-5h，除去气体用后可用稀酸、稀碱交替处理，然后水洗，加热活化来源容易，价格便宜，适于大量制备型分离聚酰胺聚酰胺(po