单克隆抗体制备技术及应用的研究进展

#综述#=天津医科大学总医院,天津300052=胡春艳(1980~),女,在读研究生,主要从事皮肤病与性病学工作。,=B=R511=1007-1040(2008)02-0116-03=单克隆抗体;制备;应用1975年,Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体[1],近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展,单克隆抗体技术的应用已日益普及,单抗的方法论几乎已经应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。11.1自单克隆抗体技术问世以来,制备单抗的一般程序是,从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠,获取脾细胞,再与骨髓瘤细胞融合,最后对单个细胞进行克隆,培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前所生产的单抗大多数是鼠源性的,但其在临床应用方面还存在着很大的弊端,主要是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱,而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱,并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短,它发挥ADCC作用的时间较短[2];其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性,使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价,另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。1.2鼠抗体的人源化改造主要方法包括嵌合抗体、表面重塑抗体和重构抗体。1.2.1从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因,与人Ig恒定区的基因连接,再插入适当表达载体,转染宿主细胞,表达人-鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上,尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断,减少了鼠源性抗体的免疫原性,从而尽可能的减少单抗的异源性,同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性,可诱发人抗小鼠反应(HAMA)[3]。1.2.2对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造,在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。所替换的片段不应过多,对于影响侧链大小、电荷、疏水性,或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基尽量保留。1.2.3由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建。1.31.3.1抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术。1.3.1.1噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[4]。1985年.Smith将外源基因插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白质基因Ó区。使目的基因编码的多肽在噬菌体表面表达.从而建立了噬菌体表面表达技术[5].其基本原理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。该技术构建方法是从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因;PCR扩增抗体全套基因片段(如VH、VL),将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体,形成组合文库;将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因Ó(g3)或基因Ø(g8)的序列,使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gpÓ或gpØ的N端。通过噬菌体展示技术能将蛋白质的基因型和表型连接起来。用固相化抗原经/亲和结合)洗脱)扩增0数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库[2,6]。噬菌体抗体库技术是目前不经过免疫116安徽预防医学杂志2008年3月20日第14卷第3期AnhuiJPrevMed,Mar.20,2008,Vol14,No.2获取特异性人源抗体的新途径,为制备对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体奠定了基础。噬菌体展示技术简单易行,筛选容量大,可在短期内筛选出100万~1亿个克隆,可获得高亲和力的人源化抗体。它直接从未经免疫的小鼠或人的淋巴细胞中得到抗体基因,可以获得完全人源化的抗体,克服了杂交瘤细胞的不稳定性的缺点。但该技术也存在一定的局限性,如库容量的有限性,密码子的偏爱性,氨基酸的修饰受宿主限制等,而且该技术依赖于细胞内基因的表达,所以一些对细胞有毒性的分子很难得到有效的表达。1.3.1.2最初称为多聚核糖体展示,是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的新技术。1994年,Mattheakis等建立了一种体外核糖体展示随机肽系统,利用/多肽-核糖体-mRNA0复合物将肽库构建在多核糖体上,借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。1997年,Hanes和Plukthun等在此基础上加以发展和完善,建立了核糖体展示技术[7]。它的基本原理是通过PCR扩增目的基因的DNA文库,同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环,并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译系统中孵育,是目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面,并形成/mRNA-蛋白质-核糖体0三元复合体,最后通过常规的免疫学检测方法,通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体,再利用RT-PCR扩增,经过多次循环过程,最终筛选出高亲和力的目标分子。该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术(如噬菌体展示)的局限性,如:需转化细菌或真核细胞,因效率不高而降低库容,减少抗体多样性等,并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降,同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于该技术是在体外翻译,体外筛选的特点,大大缩短了实验周期,省时省力,方便快速。1.3.2制备全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID小鼠)、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID),经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠:转基因小鼠技术就是将外源DNA导入到小鼠基因组中,建立小鼠基因组中带有外源基因的遗传性小鼠突变模型的方法和技术。转基因小鼠制备人抗体的优点是,其功效优于其它生产抗人体蛋白单抗技术。不足之处:(1)由于抗体是在小鼠体内装配,因而产生的单抗具有鼠糖基化模式,所以这些单抗最终并不是全人的;(2)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列,导致不十分完全的人序列;(3)转基因小鼠表达的人Ig多样性较少,而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类;(4)由于转基因小鼠片断较小,仅有30Kb,使抗体应答不足以满足抗原具有多样性。转染色体小鼠:通过微细胞介导法(MMCT方法)将人14号染色体上产生IgH的胚系片段和2号染色体上5~50Mb的J轻链片段转染到ES细胞,获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后,可产生抗人血清白蛋白的人Ig,再次免疫后产生IgM。由转染色体技术得到的小鼠,表达的人IgG各亚类的量与人血清中表达的IgG各亚类相同,且可同时在一个转基因小鼠内表达;但是,转染色体小鼠导入的人Ig片断虽然比较大,但其表达的人Ig量却比较低。22.1利用单抗进行疾病的诊断现已被广泛应用。(1)可用以检测淋巴细胞表面分子,以区分不同分化阶段的淋巴细胞,用于鉴别淋巴细胞。(2)可用于鉴定病原体,准确诊断感染性疾病[8]。将病原体的抗原分离,再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株,分泌单克隆抗体,可以同病原体发生特异性的抗原-抗体反应,通过免疫荧光试验或ELISA试验对疾病进行诊断。(3)可以用于肿瘤的诊断和分型。某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性,可用于肿瘤的诊断。目前已批准使用的诊断剂有:用于结肠癌的votomab和arcilumonab,用于探测感染部位的sulemab,用于卵巢癌的igovomab,用于黑色素瘤的tecnemabK-1。(4)激素类单抗可用于测定体内激素含量,判断内分泌的功能状态[9]。2.2目前利用单抗对疾病进行治疗已取得了很大的成果,主要是将单抗同药物耦联,再与病原体或肿瘤的特异抗原结合后发挥作用。2.2.1抗细胞表面分子单抗,可抑制同种免疫反应,主要用于移植排斥反应的防治。莫罗单抗(mu2romonab-CD3,OrthocloneOKT3)是FDA批准用于肾移植病人防止异体排斥反应的第一只鼠源型单克隆117安徽预防医学杂志2008年3月20日第14卷第2期AnhuiJPrevMed,Mar.20,2008,Vol14,No.2抗体[10]。2.2.2抗细胞因子单抗,可抑制自身免疫反应,主要用于自身免疫性疾病的治疗。单克隆抗体通过清除激活的细胞、阻滞其功能、或将升高的促炎细胞因子水平降至正常而抑制过度的免疫病理学反应。如TNF阻滞剂,用于治疗类风湿性关节炎[11][12]和节段性回肠炎取得了较好的效果。阿达木单抗(Adali2mumab)是继伊那西普(etanercept)和英夫利昔单抗(inflixmiab)之后第三代TNF-A拮抗剂,法国生产的,是最新研制的用于治疗类风湿性关节炎的单克隆抗体[13]。2.2.3抗肿瘤单抗,可用于肿瘤的导向治疗。第一个获准用于癌症治疗的嵌合型IgG-1单克隆抗体是rituxmiab(Mabthera),其作用标靶为CD20(即在前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的跨膜蛋白)。多中心临床研究显示,本品能有效治疗复发的低度滤泡型非何杰金淋巴瘤[14]。2.2.4抗血小板治疗。糖蛋白IIb/Óa受体拈抗剂能阻滞血小板活化和聚集的最后共同途径,作为急性治疗药物有明显疗效。这类拮抗剂中阿昔单抗(abcixmiab,ReoPro)是第一个通过临床评价的,EPIC临床研究证实,本品能显著降低血管成形术高危病人缺血性并发症的发生率[15]。2.2.5单克隆抗体在用于免疫治疗时的局限性。2.2.5.1单克隆抗体的特异性:由于肿瘤特异性抗原较少,缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗,而且有些对正常组织也有交叉反应。2.2.5.2异种抗体反应:鼠源性单抗用于人体,仍然是一种异体物质,可导致机体产生异源性超敏反应。2.3单克隆抗体及制备技术在抗原的分析纯化、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用,并对这些领域产生了深远的影响。3单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。在过去的三十年里,从鼠源性单抗到全人源性抗体,单抗在制备技术上取得了较大的进展。鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应,使药物的功效降低。全人单克隆抗体是制备单克隆抗体的一种新技术。它减少了鼠基因序列,减少了抗抗体反应,提高了单克隆抗体的功效和安全性。而且,当前全人源性单克隆抗体技术的灵活性,可以选择发挥单抗最优的药动学和药效学特性。在未来的几年里,全人源性单抗将作为一种新的产物更多地用于疾病的诊断、治疗及研究。=[1]KohlerG,MilsteinC.ContinuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofPredefinedspecificity.Nature,1975;256;495-497.[2]朱学泰,单克隆抗体制备技术研究进展。甘肃科技,2005,21(3)109-108.[3]Weiner,LouisMFullyHumanTherapeuticMonoclonalAntibodies.JournalofImmunotherapy.29(29):1-9,January/February2006.[4]ZhaocaiyuPreparationofsinglechainvariablefragmentofMG-7mAbbyphagedisplaytechnology,WorldJGastroenterology2001;August7(4):510-514.[5]SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsur2face.Science,1985,228:1315-1317.[6]张爱华,