利用水凝胶设计组织再生微环境

解剖科学进展　ProgressofAnatomicalSciences　2014Sep,20(5):458~462利用水凝胶设计组织再生微环境*葛丽，刘立伟，刘奇坤，石娟，宋文刚（泰山医学院基础医学院，山东泰安271000）Engineeringthetissueregenerativemicroenviromentwithhydrogel*GELi,LIULi-wei,LIUQi-kun,SHIJuan,SONGWen-gang（SchoolofBasicMedicalScience,TaishanMedicalUniversity,Tai'an271000,China）【Abstract】　Atpresent,howhydrogelsofferthreedimension(3D)microenvironmentforcellsandtissuesgrowthhasbecomeresearchhotspotintissueengineeringandregenerativemedicine.Intelligenthydrogelsmodifiedbybioactivemoleculesareimportantbiomaterials,andcanacceleratetissueregeneration.Hydrogelscanbedividedintonaturalandsynthetichydrogelsaccordingtotheirsoures.Hydrogel'sdesignstrategymainlyconsistsofseveralaspectsasfollows:hydrogel'sdesignofbiodegradablesensitivedomains,acquisitionofbiologicaladhesion,modificationofgrowthfactorsandcytokines,inaddition,thevascularremodelingoftissueswasalsodiscussedemphatically.【摘要】　水凝胶如何为细胞、组织的生长提供三维微环境已成为组织工程和再生医学领域的研究热点，生物活性分子修饰获得的智能水凝胶是能够促进组织再生的重要生物材料。根据水凝胶的来源，可将其分为天然和合成水凝胶两种类型。水凝胶的设计策略主要包括凝胶降解敏感位点的设计、生物黏附性的获得、生长因子和细胞因子对凝胶的修饰以及再生组织的血管重建。此外，本文以智能水凝胶在软骨组织工程、神经组织工程等方面的应用为例，阐述了水凝胶在组织工程和再生医学领域的突出研究进展。【中图分类号】　R318.08　【文献标志码】　A　【文章编号】　1006-2947(2014)05-0458-05【收稿日期】2014-05-04【基金项目】国家自然科学基金项目（81172791）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目BS2009SW009；山东省医药卫生科技发展计划项目2011HZ105*通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed)（）（）目前迫切需要改进组织损伤的临床治疗方案，以更加有效地促进组织的修复和再生。生物支架材料在组织工程和再生医学中扮演着重要角色，其能为细胞生长和新生组织沉积提供机械支持和发育引导。随着对生物材料的研究和对干细胞生物学以及细胞信号网络复杂性的深入理解，多种新型生物材料已开发出来，这为组织工程和再生医学在临床中的应用开辟了一条崭新的道路。传统再生医学的治疗理念是利用来自体内的重组细胞替代损伤组织，这会耗费大量人力和资金；然而随着新型生物材料的开发利用，将负载生物活性分子的生物材料移植进入损伤部位，不但能够节约人力和资金，而且能够改进治疗微环境、控制宿主细胞的修复过程。目前，在大量生物支架系统中，水凝胶是组织工程应用最广泛的类别之一。水凝胶是一种含有多种亲水基团，能在水中溶胀形成三维网络结构的高分子聚合物。水凝胶本身具有生物惰性，但经过生物活性分子修饰后，其能够对外界环境如温度、pH、离子浓度、电、光、磁场等微小的变化或刺激产生显著应答并能随之发生突跃性[1]改变，此类称之为智能水凝胶。智能水凝胶能够高度模拟天然细胞外基质（extracellularmatrix,ECM），其不但具有生物相容性，而且能够引导细胞生长和新生组织的重塑。目前，智能水凝胶在组织工程和[2]再生医学中的应用备受关注。本文讨论了可移植智能水凝胶在组织工程和再生医学中的最新研究进展和应用，其整合了当前对细胞信号、干细胞生物学和材料设计的理解。我们强调了可溶性信号分子和ECM蛋白在指导细胞行为以及它们与天然来源水凝胶和合成水凝胶整合过程中的作用。尤其是，重点关注用大量信号分子如蛋白酶敏感结构域、细胞黏附配体、生长因子和细胞因子使水凝胶功能化，并且诱导其形成自组装的微血管网络，以此设计一种能够促进损伤组织修复的再生微环境。1　水凝胶的分类1.1天然水凝胶天然水凝胶可从自然界中直接获得，包括明胶、胶原、纤维蛋白、藻朊酸盐、透明质酸、琼脂糖、壳聚糖等。天然水凝胶具有特异的细胞作用靶点，对细胞的亲和性好。[3]天然水凝胶也可以被简单的修饰，如胶原，能通过酶促反应进行交联，也可将其压缩成高密度蛋白、进而调整胶原水凝胶骨架的机械完整性，还可以通过天然的相互作用或通过化学偶联把一些信号分子掺入胶原中以改善其生物活性。对于明胶，虽然机械强度低，但可通过物理或化学交联来改善。而透明质酸，则可通过羧基和N-乙酰基群修饰，使其具有更强的疏水性。医用透明质酸钠水凝胶和医用可吸收明胶海绵加以物理混合制备成的可注射水凝胶，具有可注射性、安全性等特性，是一种良好的药物缓释载体，在治疗内耳疾病的鼓室局部给药[4]法中，其能够成为可供选择的药物载体之一。但天然水凝胶在生物医学应用方面也存在缺陷，如不易大量获取、材料重复性差、结构和性能不易被人工调控等。1.2合成水凝胶为了更好的控制凝胶的性能，越来越多的合成大分子聚合物水凝胶出现，包括聚丙烯酸盐、聚丙[1]烯酰胺类及其衍生物、聚氧化乙烯及其衍生物等。合成水凝胶有许多优势，如能够大规模生产、可以在制备过程中改变凝胶的结构、力学性能等来适应不同组织的需要，且材料重复性好。但是，其不足之处在于缺乏细胞识别信号，对细胞的亲和力差。这里简要介绍最具代表性的两种合成水凝胶：聚酯水凝胶和自组装多肽。聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）是最典型的聚酯水凝胶，它是一种具有骨干架构的亲水性聚乙醚复合物，能与水形成广泛的氢键。基本的PEG水凝胶包含两个羧基末端基团，其通常可以被多种生物活性基团修饰。研究发现，哺乳动物体内的酶类对PEG水凝胶的降解性较低，因此PEG水凝胶在[5]临床上已被用作药物的递送载体。另有研究者设计了一种复杂的PEG水凝胶，其包含多个生物敏感反应部位，其不仅能够支持人皮肤成纤维细胞的黏附和存活，而且也能被包被在其中的成纤维细胞分泌的基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMPs）[6]降解，以利于组织的形成。目前，PEG水凝胶已被[7][8]广泛用于组织工程、干细胞分化调控和生物活性[9]分子的递送中。其它类型的聚酯水凝胶，如聚氧化乙烯（polyethyleneoxide,PEO），也能被组装成ECM类似物，其可以提供大量羟基以附着各种合成寡肽。另有一些具有弹性的共聚物如聚对酞酸—乙二酯共聚物（Polyethyleneterephthalate,PET），可以被挤压形成独特的几何形状，以促进细胞在三维（threedimension，3D）空间结构中的排列。这些聚酯类材料可以被修饰成具有表面微纹理的水凝胶，以增强细胞的锚定及肽或其它细胞所需成分的黏附，这为[10]细胞的生长和组织的再生提供了优越的微环境。近年来，由自组装多肽合成的水凝胶相继出现，其能更好地体现合成水凝胶的生物相容性和生物降解性。一般来说，重组多肽经特殊设计以能够在生理条件下自组装，与典型的化学交联或偶联过程相比，其能为细胞在水凝胶中的生长建立更加有利的微环境，目前已被广泛应用于细胞培养、药物[11]缓释、组织工程和再生医学等方面。自组装多肽水凝胶通常不具有生物活性，不容易降解。因此，要产生一种具有生物活性的基质，必须在构建的肽水凝胶结构框架中掺入有生物活性的结构域和信号分子。弹性蛋白样多肽能够被设计以自组装成特定的纳米结构，其会对温度、离子强度、氧化还原状态和PH做出恰当的反应；为提高其生物学功能，现已用多种细胞黏附因子对弹性蛋白样多肽进行修饰。2　水凝胶的设计无论天然水凝胶还是人工合成水凝胶，其本身都是一种生物惰性物质，为使其具有类似ECM的生物反应特性，需要对其进行人工修饰，即通过生物物理或化学方法向凝胶中掺入一些生物活性分子或特殊序列，使其在植入后能够调节细胞间的相互作用，支持细胞正常的生命活动，以完成对创伤修复微环境的调控。目前，水凝胶设计的主要步骤包括凝胶降解敏感位点的设计、生物黏附性的获得、生长因子和细胞因子对凝胶的修饰以及再生组织的血管重建。2.1设计水凝胶降解敏感域在组织形态发生期间，细胞的重塑过程包括细胞迁移、侵入和结构的变化，以创造具有特定功能的器官或组织形态。ECM的生物化学成分和机械结构决定了细胞的增殖和分化，并且ECM的降解速率[12,13]能够影响细胞的形态发生过程。水凝胶是一种生物惰性材料，若不能适时降解，会抑制细胞的侵入和组织的重塑，因此必须对其进行可降解修饰。理·459·2014年第20卷第5期葛丽等利用水凝胶设计组织再生微环境·460·解剖科学进展2014年第20卷第5期想情况下，凝胶的降解速率应该与组织的形成速率相匹配，这样既能够维持凝胶的机械稳定性，也能为新生组织的发育提供充足的空间。因此凝胶的生物降解特性在生物医学应用中是必不可少的。凝胶的生物降解方法分为物理降解和化学降解。物理降解主要是利用外界环境中温度、PH、光照强度的变化或可水解交联酯键的断裂使凝胶降解。化学方法应用较为广泛，即由细胞介导的凝胶降解，通过应用可降解肽，如胶原酶、明胶酶和其[1]它MMPs的底物来形成一种肽-聚合物水凝胶，细胞通过分泌对应的酶来降解凝胶。在组织损伤的天然治愈过程中，来源于纤维蛋白原和明胶的小肽序列可以被纤溶酶和胶原酶选择性降解，这恰是用来赋予凝胶蛋白水解敏感特性的典型序列。目前，不同的凝胶设计中已引入多种肽序列，使凝胶具有蛋白水解能力，如PEG凝胶骨架中植入的弹性蛋白酶敏感底物、纤溶酶敏感底物、胶原酶敏感底物，可以允许成纤维细胞和平滑肌细胞在凝胶基质内增殖、迁移，然而在缺乏蛋白酶底物的凝胶中，这一过程[14]会明显减弱。研究表明，PEG凝胶中掺入不同蛋白水解底物，会对细胞的增殖和迁移速率产生显著影响，因此，选择合适的底物对于每一种特定应用都是非常重要的。尽管向凝胶中掺入一些降解敏感序列能够赋予凝胶生物降解性，但凝胶的适时降解还未能完全与新生组织的形成速率相匹配，因此会在组织生长过程中限制细胞的迁移、影响组织再生，这是目前凝胶降解设计策略亟待解决的问题。2.2水凝胶生物黏附性的获得水凝胶封装移植物需要将其锚定，使移植物与周围环境发生共价或非共价交联，这需要水凝胶骨架上有特定配体，从而为细胞的增殖、分化、迁移和凋亡提供附着点。整合素是细胞表面的主要受体，介导细胞与ECM粘附，进而影响细胞的生命活性。整合素的胞内结构域与细胞骨架蛋白或其它信号复合物相互作[15]用，在细胞内外传递机械和化学信息。为促进整合素结合到生物材料表面，起初选用全长ECM分子，如纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白，以使聚合物材料功能化。目前研究发现，在ECM蛋白序列内有能与整合素结合且能够使生物材料功能化的最小氨基酸序列，这些短肽序列较全长ECM分子的合成更加便捷，并降低了成本，更重要的是降低了免疫原性和一些以全长蛋白为生物来源的病原体传播的风险。目前使用最普遍的、能结合整合素的氨基酸序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，[16]这种R